HAFTA III Bağlantı, Asosiyasyon, Haritalama Biyoteknoloji ve Genetik I HAFTA III Bağlantı, Asosiyasyon, Haritalama Prof. Dr. Hilâl Özdağ

T.H. Morgan ve A.H. Sturtevant 1911 Morgan’ın soruları: Gen ayrılmasının kaynağı nedir? Janssens ve ark: kiyazma Görünüşteki ayrılmanın frekansı, niçin çalışılan genlere bağlı olarak değişti? Bir kromozom boyunca birbirine nispeten yakın olan iki genin kendi aralarında kiyazma oluşturması, kromozomda birbirleri arasında daha uzak mesafede bulunan genlerinkine oranla daha azdır. Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Rekombinasyon Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Bağımlı düzenlenme Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Değiş tokuş Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Tam bağlantı/Bağımsız düzenlenme Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Değiş Tokuşun Etkisi Bağlantılı iki gen arasındaki uzaklık çok fazla olduğunda rekombinant gametlerin sayısı %50’ye ulaşır ama bu oranı geçmez. Eğer %50 oranında rekombinant oluşmuşsa dört tipi (ikisi atasal, ikisi rekombinant gamet) 1:1:1:1 oranı ile sonuçlanır. Böyle bir durumda bağlantılı iki genin aktarımı birbiriyle bağlantılı olmayan birbirinden bağımsız olarak açılım gösteren genlerin aktarımından ayırt edilemeyecektir. Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Rekombinant/Non Rekombinant

Cis/Trans Cis Rekombinant olmayan gametler ya iki yabanıl tip ya da iki mutant tip alleli alır. Trans Rekombinant olmayan gametler mutant allellerden birini veya diğerini alır. Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Rekombinasyon Rekombinasyon allellerin yeni kombinasyonlarla düzenlenmesi durumudur. Bağımsız düzenlenme ile oluşmuş kromozomlar arası (interkromozomal) rekombinasyon farklı kromozomlar üzerindeki allellerin dağılmasıdır. Değiş tokuş ile oluşmuş kromozom içi (intrakromozomal) rekombinasyon ise aynı kromozom üzerindeki allellerin yeni kombinasyonlar oluşturmasıdır. Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Rekombinasyon Sıklığı Rekombinant sıklığı= (rekombinant döl sayısı/toplam döl sayısı)x%100 Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Genetik Harita Genetik harita genlerin bir kromozom üzerindeki sırasını ve rekombinasyon sıklığına göre aralarındaki yaklaşık uzaklığı verir. Genetik haritalarda %1’lik rekombinasyon 1 harita birimine yani 1 sentimorgana eşittir. İki gen arasındaki çift değiş tokuş saptanamaz bu nedenle uzak genler arasındaki genetik uzaklık çok güvenilir olarak olarak hesaplanamaz. Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Değiş Tokuş Tipleri Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Üç Nokta Test Çaprazı Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Rekombinasyon Sıklığı-Genlerin Yerleşim Sırası İki nokta test çaprazında rekombinasyon sıklıkları M ve N %22 M ve O %6 N ve O %16 N ve P %50 O ve P %50 M ve P %50 M, N, O ve P’nin sırası ve aralarındaki genetik uzaklık nedir? 6 16 M O N Bağımsız düzenlenme %50 rekombinasyon sıklığı ile (bağlantısız) sonuçlanır.

Üçlü Test Çaprazında Haritalama 50 + 52+ 5 + 3 755 X 100 = 14.56 st – ss distance 50 + 52 + 43 + 41 X 100 = 24.63 st – e distance 5 + 3 + 43+ 41 X 100 = 12.18 m.u. ss – e distance 14,56 12,18 st ss e 24,63 st, e ve ss’ye göre ss, e ve st’ye göre Çift değiş tokuşlar için düzeltme 50 + 52 + 43 + 41 + 5 + 3 + 5 + 3 755 X 100 = 26.75 e, st ve ss’ye göre

Doğru Sıranın Belirlenmesi Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Üç Nokta Haritalama Dikkate alınan tüm lokuslar bakımından birey heterozigot olmalıdır. Eğer herhangi bir lokusta homozigotluk olursa, ortaya çıkacak olan bütün gametler aynı alleli içerecekler ve dolayısıyla haritalama analizi engellenecektir. Çaprazlama deneyi bütün gametlerin genotipinin ortaya çıkan yavru bireylerin fenotiplerini gözlemlemek yoluyla doğru olarak saptanabileceği tarzda planlanmalıdır. Aksi takdirde gametler ve onların genotipleri asla doğrudan doğruya gözlenemez. Haritalama deneylerinde bütün değiş tokuş sınıflarının temsili bir örneğini bulmak için yeterli sayıda yavru bireyin oluşturulması gerekir.

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/biology/biology.html http://www.wellscenter.iupui.edu/MMIA/cytogenetics/01_cytogeneticsbeg.swf

İNSAN GENOMUNDA HARİTALAMA

Somatik Hücre Hibridizasyonu Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Somatik Hücre Hibridizasyonu Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

In Situ Hibridizasyon http://www.wellscenter.iupui.edu/MMIA/cytogenetics/01_cytogeneticsbeg.swf Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

DNA Dizileme

Pozisyonel Klonlama Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,

Genetik Belirteçler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) Microsatellite Polymorphism SNP (Single Nucleotide Polymorphism)_ 10.000.000 STR (Short Tandem Repeat)_ 10.000 http://www.le.ac.uk/ge/maj4/SNP_STR.jpg http://www.biology.arizona.edu/human_bio/activities/blackett2/gifs/blackett.gif http://www.testadn.ch/images/profil.jpg

Varyasyon Mutasyon popülasyonda görülme sıklığı < %1 Polimorfizm popülasyonda görülme sıklığı > %1 İnsan genetik varyasyonlarını tespit edebilme ve ölçme yöntemlerinin gelişmesi bireyler arasındaki farklılıkları ve benzerlikleri çalışmamıza olanak tanır. Varyasyon Tipi Keşfedildiği veya sıklıkla kullanıldığı yıl Birinci nesil RFLP (restriction fragment length polymorphism) 1980 İkinci nesil VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) or Minisatellite 1985 Üçüncü nesil Microsatellite or STRP (Short Tandem Repeat Polymorphism) 1989 Dördüncü nesil TNP (Single Nucleotide Polymorphism) 2000 Beşinci nesil CNV (Copy Number Variation) 2005 Altıncı nesil Whole Genome Sequencing günümüzde RFLP Restriksiyon enzimleri ile oluşturulan parça uzunluklarındaki farklılıklar VNTR (Minisatelit) 15 veya 100 bç uzunluğunda genlerin içinde veya arasında olabilirler STR (Mikrosatelit) Kodlamayan bölgede (çöplük (junk) DNA) olan, değişik motif ve uzunluklardaki (2- 10 baz çift) ardışık, orta sıklıkta tekrarlayan nükleotid dizileridir TNP DNA sekansında tek bir nükleotidin (A, T, C veya G) farklı olma durumu (insan genomunda her ~300 bç de 1 TNP) CNV Her DNA’nın ~30,000 gen kodlaması ve genel olarak teoride genomda bir genden 2 kopya olması beklenir, fakat DNA’nın büyük bir kesiminde genler farklı kopya sayısında bulunurlar Genomdaki genetik varyasyonlar: polimorfizmler ve mutasyonlar olmak üzere iki ana grup altında incelenir. Canlının genetik bilgisinde (DNA) meydana gelen ve kuşaktan kuşağa aktarılan kalıtsal değişimler mutasyon olarak tanımlanır ve genel olarak kromozom yapısının değişimi, kromozom sayısının değişimi genlerdeki insersiyon/delesyon gibi değişimleri kapsayan ve toplumda nadir görülen (%1’in altında) farklılıklardır. Diğer varyasyon çeşidi olan polimorfizmler ise toplumda (bir gen veya kromozomun, iki veya daha fazla) sık rastlanan alelinin varlığıdır ve alel sayısı arttıkça toplumda o gen için polimorfizm artar. Toplumda yaygın olarak (%1-2) görülen polimorfizmler bir bireysel farklılıktır ve genlerdeki bu bireysel farklılıklar kişilerin farklı fiziksel özelliklerinden, hastalıklara yatkınlıklarından, hastalıklara dirençlerinden sorumludur. Bütüncül biyolojik yaklaşımı temel alarak geliştirilen mikrodizin teknolojisiyle, bir canlının sahip olduğu tüm genom, transkriptom ve çeşitli protein aile profilleri altında proteom analizleri hızlı bir şekilde yapılabilmektedir. Bütüncül yaklaşım ve gelişen teknolojiler sayesinde günümüzde “kişisel tıp” olarak isimlendirilen ve kişinin tüm sağlık sorunlarını bireysel düzeyde ve en etkin yolla çözmeyi amaçlayan analiz yöntemlerinin geliştirilmesine çalışılmaktadır. Bu doğrultuda yapılacak olan araştırmalar, hasta olan kişinin en kısa sürede, en etkin yöntemlerle tedavi edilmesini, hastalığa yakalanmadan, gelecekte kendisinde var olabilecek hastalık çeşitlerinin saptanmasını, bu hastalıklara karşı “kişisel koruyucu tıbbın” geliştirilmesine olanak sağlayabilecektir.

TNP, Mutasyon, MAF, Gobal MAF Değişim > %1 ise Polimorfizm Değişim < %1 ise Mutasyon G A 0,50 Transisyon Purin/Purin Pirimidin/ Pirimidin C T 0,49 transversiyon Purin/Primidin C G 0,1 Popülasyonda en az yaygın allel frekansına MAF denir dbSNP = Common varyant (yaygın) MAF > % 1 Global minor allel frekansı (MAF) =0,49 – en sık rastlanan 2. allel 1000 Genome faz 1 rs222 raporu: "MAF/MinorAllelSayımı:G=0.262/330". rs222’nin minor alleli 'G‘ frekansı26.2% 629 kişilik örnek popülasyonda 330 kez 'G' gözlenmiştir http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/docs/glossary/#common

TNP, Haplotip, Tag TNP a. TNP’ler: 4 farklı insana ait aynı lokasyonda dört kromozomal bölgedeki TNP’ler. Dizinin çoğunluğu aynı olmasına rağmen varyasyonun olduğu 3 farklı baz gösterilmiştir. Her TNP 2 allel olasılığına sahiptir. 1. TNP’de C ve T alleleri mevcuttur. b. Haplotip Blokları: Haplotip blokları yan yana TNP’lerin kombinasyonudur. Örnek olarak 20 TNP bloğu temsili olarak gösterilmektedir, panel a’daki 3 temsili TNP b’de işaretlenmiştir. Bu panelde popülasyon üyeleri genelde 1-4 haplotipini göstermektedir. c. Tag TNP’ler : Bu 20 TNP içerisinden 3 tanesi 4 Haplotipi benzersiz olarak tanımlamaktadır. Eğer bir kromozomda A-T-C deseni var ise bu örnek haplotip1 olarak saptanır. (The International HapMap Project, December 2003

Varyasyonların Kullanım Alanları 1. Model bağımlı analizler (Parametrik Analizler): Kromozom yerleşimi kesin olarak bilinen bir genetik gösterge kullanarak bu göstergenin kuşaklar boyunca birlikte kalıtılıp kalıtılmadığını gösterme esasına dayanmaktadır Aynı kromozom üzerinde birbirine çok yakın yerleşimli genlerin ya da polimorfik markırların mayoz sırasında parça değişimine uğraması (crossing over) ve birbirinden bağımsız olarak bir sonraki kuşağa kalıtılması çok zordur Yani bir kromozom üzerinde birbirine çok yakın yerleşimli genler mayozda yeniden şekillenmezler ve yavru kuşağa daima birlikte aktarılırlar. Bu olaya bağlantılı kalıtım (linkage) adı verilmektedir. LD: yeniden şekillenme olmaksızın TNP allel çiftleri için tesadüfi ilişkilendirilme ölçüsüdür D’, r2, LOD ile ölçülür. Tag TNPler: bir haplotip’i tanımlayabilmek için minimum TNP setidir r2= 1 e eşit olduğunda iki TNP bolluk içerisindedir ve birin varlığı diğerinin varlığına işaret eder.) LD gen haritalanmasında kompleks hastalıkların haritalanmasında genom boyunca ilişkilendirme çalışmalarında evrim çalışmalarında 2. Modelden bağımsız analizler (Parametrik olmayan analizler): Hastalık ile genetik gösterge arasında anlamlı bir ilişki bulunmaya çalışılır Asosiyasyon analizlerinde hastalıkla genetik göstergenin kuşaklararası birlikte kalıtılması sınanmaz bunun yerine hastalığın ortaya çıkmasında rolü olabilecek genler belirlenir; bu aday genler içinde yer alan polimorfik DNA değişiklikleri saptanır ve bu değişikliği oluşturan aleli ile hastalık aleli arasında ilişki olup olmadığı araştırılır Tam bağlantı durumunda genetik gösterge aleleri ile hastalığın birlikte kalıtımı tamdır (Linkage).

Bağlantı Analizi http://www.mdc-berlin.de/thierfelder/bilder/project4_g.jpg http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/images/linkage-analysis.gif Bağlantı analizi Hastalık patogenezinin verdiği ipuçları “ÖNCE” Pozisyonel Klonlama Pozisyonel aday Biyolojik Aday SİMDİ Bağlantı analizi Biyolojik adaylık Değerlendirilmesi ve lokus verisinin bütünleştirilmesi İfade profillerinin genom Ebadında analizi, proteombilim, metabolombilim http://genomebiology.com/content/figures/gb-2003-4-10-119-1.jpg