Protein Saflaştırılmasındaki Basamaklar

Gen dizisi  transkriptler   primer protein ürünleri   fonksiyonel proteinler (DNA) (mRNA) Transkripsiyonel kontrol Translasyonel Translasyon sonrası Kontrol (post-translasyonel modifikasyonlar) DNA RNA PROTEİN MOLEKÜLLER ARASI ETKİLEŞİM Nasıl? Neden? Nükleik asitlerle ilgili teknikler Proteinlerle ilgili teknikler Nükleotid dizisinin belirlenmesi mRNA analizleri Protein yapı analizleri Protein fonksiyon analizleri

AKTİF BİR PROTEİN OLUŞURKEN 400’DEN FAZLA KİMYASAL MODİFİKASYONUN GERÇEKLEŞEBİLECEĞİ ÖNGÖRÜLMEKTEDİR. İNSANDA: 30.000 GEN 250.000 – 500.000 PROTEİN

Bir proteinin nasıl izole edileceğine, hangi yöntemle ve ne derece saflaştırılacağına karar verirken göz önünde bulundurulan kriterler: AMAÇ; MATERYALİN VE ÇALIŞILACAK PROTEİNİN TİPİ VE MİKTARI; İŞLEMLERİN SÜRESİ VE MALİYETİ; ELDEKİ OLANAKLAR

Protein denatürasyonundan ve inaktivasyondan korunmak için çalışmanın her aşamasında pH ve SICAKLIK kontrol altında tutulmalıdır! Sıcaklığın olumsuz etkisi, işlemlerin SOĞUKTA (genelde 4oC’da) gerçekleştirilmesiyle önlenir. pH ise bu moleküllerin fizikokimyasal gereksinimleri doğrultusunda hazırlanmış tampon çözeltilerin kullanımı ile istenen değerde tutulur.

Ortam pH’sının 7 ve 7’ye yakın değerlerde olduğu koşulda en geniş çapta kullanılan tamponlar tris ve fosfat tamponlarıdır.

TAMPON SEÇİMİNDE DİKKAT EDİLMESİ GEREKENLER: Çalışma pH’sı, Tamponun anyonik veya katyonik karakterde olması, İyonik kuvvet ve sıcaklık etkisiyle pH değişimi, Kimyasal etkinlik, Biyolojik etkinlik, Diğer bileşenlerle etkileşim, Biyolojik membranların geçirgenliği, Toksisite, 280 nm ve altındaki dalga boylarında absorbsiyon, Maliyet, Çözünürlük

Başlıca Materyaller BİYOLOJİK MATERYALLER: MİKROORGANİZMALAR HAYVANSAL ÖRNEKLER HAYVAN DOKU VE HÜCRE KÜLTÜRLERİ BİTKİLER VE BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİ

HOMOJEN VE HETEROJEN KARIŞIMLARI AYIRMA VE SAFLAŞTIRMA YÖNTEMLERİ İKİ (ÇOK) FAZLI AYIRMA YÖNTEMLERİ Yardımcı bir faz oluşturarak ayırma (EKSTRAKSİYON, KROMATOGARFİ, ELEKTROFOREZ) Kimyasal reak. sonucu faz oluşturma (ÇÖKTÜRME) Isıtma veya soğutma ile faz oluşturma (KRİSTALİZASYON, DESTİLASYON, SÜBLİMASYON, EVAPORASYON) TEK FAZLI AYIRMA YÖNTEMLERİ SANTRİFÜJLEME FİLTRASYON DİALİZ

Homojenizasyon (Parçalanma) ve Yöntemleri

HOMOJENİZASYON: Çalışılacak molekül grubunu içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar yapılarını parçalama işlemi Fiziksel işlemler Mekanik işlemler Ultrasonikasyon Ozmotik şok Dondurma-çözme Kimyasal işlemler Çözücülerin kullanılması Enzimlerin kullanılması

Homojenizasyon (Parçalanma) ve Yöntemleri Çalışılacak molekül grubunu (nükleik asit ya da protein) içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar yapıları parçalanıp yok edilmesine homojenizasyon denir. Cam homojenizatör kabında pistonun düzenli dönüşü ya da vuruşu ile sağlanan mekanik güçle, hücreler piston ve cam çeper arasında sıkıştırılır  hücre zarı parçalanır, hücre içeriği tampona geçer, elde edilen süspansiyon, bütünlüğü bozulmamış birçok organeli içerir ki bu da HOMOJENAT olarak adlandırılır.

Homojenizatör

Hücreleri parçalayarak fraksiyonlara ayırma yöntemleri, temelde hücre sınırlarının çeşitli fiziksel ya da kimyasal tekniklerle yok edilmesini kapsar. Geliştirilen çeşitli teknikler sayesinde bir dokudaki farklı hücre tiplerini birbirinden ayırmak mümkün olduğu gibi dikkatli bir çalışma ile organeller de oldukça sağlam bir şekilde elde edilebilirler. Homojenizasyon yöntemleri genel olarak 2 kısma ayrılmaktadırlar; a)Fiziksel Yöntemler i) Mekanik işlemler ii) Ultrasonikasyon iii) Ozmotik Şok iiii)Dondurma- Çözme b)Kimyasal Yöntemler i) Çözücülerin Kullanılması ii) Enzimlerin Kullanılması

a)Fiziksel Yöntemler i)Mekanik Yöntemler : Bu tip tekniklerin en basit ve ilkel olanı materyali bir havan içinde kum ile öğütlemektir. Ezme sırasında alumina, kum ya da cam tozu katılacak olursa parçalama etkinliği artar. Ezerek parçalamada daha gelişmiş şekilde doku veya hücrelerin (liquid N2) sıvı azotta (-196 °C) ya da -20 --- -70°C’da dondurulan soğuk havanlarda yapılır. Donmuş hale gelen dokular toz hale gelene kadar kolaylıkla parçalanabilmektedir fakat dokularda çözünme olmadan kısa sürede bitirilmelidir. Günümüzde mekanik olarak parçalama da farklı tipte amaca uygun homojenizatör adı verilen aletler kullanılmaktadır.

ii)Ultrasonikasyon : Hücre süspansiyonuna daldırılan sonikatör, titreşim yaparak ve yüksek ses dalgalarıyla hücre bütünlüğünü bozar. Bu amaçla kullanılan aletler (ultrasonikatör) elektrik enerjisini kesikli karakterde mekanik enerjiye çevirerek, titanyumdan yapılmış bir sonda yardımıyla ultrases dalgalarını solüsyon içindeki materyale iletir. Bu tür parçalama işlemleri sırasında açığa çıkan ısıyı yok etmek için uygun soğutmaların yapılması gerekmektedir.

Sonikatör

iii)Ozmotik Şok: Hücre duvarı (çeperi) bulunmayan ya da yok edilmiş hücreler için uygun olan ve hücrelerin yüksek ozmotik basınçlı bir çözeltiden, hipotonik bir ortama geçirilmesi durumunda, suyun hücrelerin içine girmesi ile zarlarda patlamaya yol açması durumunda meydana gelen homojenizasyondur. iiii)Dondurma – Çözdürme: Hücrelerin çok düşük sıcaklık derecelerinde (örneğin, -20°C ) tutulup sonra yeniden ısıtılarak çözündürülmesi ve bu işlemin birkaç kez tekrarlanması parçalanmaya yol açar.

b)Kimyasal Yöntemler i)Çözücülerin Kullanılması: Hücre zarında bulunan bileşiklerin çözündüğü uygun bir solvent (çözücü) yardımıyla zar yapısının eritilmesidir. Bu amaçla kullanılan organik çözücüler (örneğin, etil asetat, toluen vb.) zardaki lipitleri, deterjanlar (SDS) ise uygun şartlarda protein ve lipoprotein ile etkileşime girer ve uzaklaştırır. ii)Enzimlerin Kullanılması: Bu amaçla kullanılan litik enzimler özellikle mikroorganizmalar için uygundur. Gram (+) ‘lerde bakteri duvarının yıkılması için lizozim enzimi kullanılırken Gram(-) ‘lerde ise EDTA(kimyasal) uygulamasına tabi tutulması gerekmektedir. Kimyasal parçalama yöntemleri ısı, yüksek basınç, gürültü gibi olumsuz faktörlerin ortaya çıkmaması gibi nedenlerle fiziksel yöntemlere göre üstünlükler taşır

B) Ayırma (Seperasyon), Saflaştırma (Purifikasyon) ve Analiz Yöntemleri Ayırma (Seperasyon): Parçalamayı ardışık olarak, üzerinde çalışılacak molekül grubunun homojenattaki diğer moleküllerden uzaklaştırılması işlemine ayırma denir. Saflaştırma (Purifikasyon): Ayırma işlemine uğramış molekül grubunun ortamda herhangi bir yabancı madde olmayacak şekilde elde edilmesine ise saflaştırma denir. Analitik Teknikler: Ayırma ve saflaştırma işlemlerinden sonra, üzerinde çalışılan molekülün nicel ve/veya nitel analizi amacıyla kullanılan tekniklere denir. Bir makromolekülün homojenattan ayrılması, saflaştırılması ve/veya analiz için kullanılan tekniklerin başlıcaları,

B.1)Süzme (Filtrasyon) Homojenantın filtre edici bir materyalden (filtre kâğıdı, sinterli cam huni ve zar(membran)) filtreler) geçirilerek, süspansiyonda bulunan partiküllerin sıvı kısımdan ayrılmasıdır. Süzme işleminde çok farklı filtre kâğıtlarının olmasıyla birlikte amaca en uygun olan seçilir ve sisteme uygulanan vakum veya basınç ile işlem hızlandırılabilir.

Membran Filtrasyon Düzenekleri

B.2)Ultrafiltrasyon Membran filtrelerle yapılan bu filtrasyonda moleküllerin boyut, biçim ve/veya yüklerine göre ayrılması sağlanır. Ayrımı yapacak olan molekülleri içeren solusyon dışarıdan oluşturulan bir kuvvetle yarı geçirgen bir zardan geçmeye zorlanır. Filtrelerde, genellikle 2 tabakalı olanlar kullanılır; birinci tabaka yüzeyde bulunan ince (0.1 – 0.5 µm), selüloz asetat, naylon, polivinilidinden yapılmış bir zar, ikinci tabaka daha kalın, inert ( etkisiz) bir destek tabanıdır. Bu tip filtreler partiküllerin yüzeyde kalmasını sağlar. homojenat hücreler/ proteinler membran

B.3)Diyaliz Bu teknik seyreltik bir çözeltideki moleküllerin boyutlarına göre ayrılması temeline dayanır. Bu tekniğin en temel uygulaması değişik büyüklüklerdeki molekülleri içeren çözeltinin, makromolekülleri geçirmeyen fakat su vb. küçük moleküllerin geçişine izin veren, yarı geçirgen bir zardan yapılmış diyaliz tüpüne konulup düşük iyonik kuvvette uygun bir tampona (veya saf suya) daldırılması şeklinde gerçekleşir.

Diyaliz Tüpü. Büyük moleküller diyaliz tüpünün içinde hapsedilmiş olarak kalırken, küçük moleküller yarı geçirgen zardan her iki yöne doğru hareket ederler.

Vücutta birikmiş üre gibi zararlı maddelerin ve aşırı suyun bir membran aracılığı ile vücuttan uzaklaştırılması işlemidir. İlerlemiş böbrek yetmezliğinin tedavisinde kullanılır. Diyaliz tedavisi bozulmuş böbrek işlevlerinin bir kısmını düzenleyerek yaşamın devam etmesini sağlar. 30-40 yıl önce ilerlemiş böbrek yetmezliği olan hastalar günler-haftalar içinde kaybedilirdi. Diyaliz teknolojisinde sağlanan gelişmeler, bu hastalarda önce yaşam süresini uzatmış, daha sonra yaşam kalitesinin artmasını sağlamıştır.

B.4)Dondurarak Kurutma (liyofilizasyon) Liyofilizasyon, donmuş durumdaki bir çözücünün vakum altında doğrudan gaz haline geçmesini (buharlaşmasını) sağlayan sublimasyon ( arıtma) temeline dayalı bir dondurma tekniğidir. Genellikle yüksek ısıya duyarlı materyallerin kurutulması ya da konsantre edilmesi ( yoğunlaştırılması) için kullanılan yöntemlerden biridir.

Liyofilizatör

B.5) Çöktürme Su veya başka bir çözücü içeren bir ortamda istenilen ya da istenmeyen moleküllerin çöktürülerek katı halde ayrılması temeline dayanmaktadır. Örneğin, amonyum ve sodyum sülfat proteinleri çöktürmekte sıkça kullanılan inorganik tuzlardır. B.6) Enzim Uygulaması Örneğin proteinlerin proteazlarla, nükleik asitlerin de nükleazlarla parçalanarak ortamdan uzaklaştırılması esasına dayanır.

B.7) Santrifüjleme Santrifüj adı verilen aletler yardımıyla, yüksek hızda döndürülerek merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin davranışı temeline dayanır. Santrifüjler, temelde dönüm sağlayan bir motor ile tüplerin konulduğu bir rotordan oluşur. Santrifüj kuvveti (F) aşağıdaki eşitlikle ifade edilir. F= mw2r F =santrifüj kuvvetinin derecesi m =çökelen partikülün etkin kütlesi w =dönümün açısal hızı (radyan / saniye) r = göç eden partiküllerin merkezdeki dönüm eksenine olan uzaklığı (cm) F değerinin, yerçekimi kuvvetiyle (g) ilgili olarak, daha genel bir ifadesi göreceli (rölatif) yer çekimi kuvveti (RCF) dir. RCF = (1.119×10-5)(devir/dakika)5 (r) Bu eşitlik RCF’nin, örneğin dakikadaki dönüm sayısı (devir/dakika, ‘rpm’) ve çökelen partiküllerin dönüm ekseninden uzaklığı (r) ile değiştiğini gösterir. RCF değeri, ×g olrak gösterilir.

Düşük Hızlı Santrifüjler: *Tam hücreleri, deney ortamından ayırır. *En yüksek hızlı olanları 4.000-5.000 devir/dakikadır. *Genelde oda sıcaklığında çalışırlar ve sıcaklık kontrolleri yoktur. *Rotorları sabit açılıdır. *Genellikle 12ml ya da 50ml’lik santrifüj tüpleri kullanılır. *Daha çok sıvı besi ortamları ya da süspansiyondaki hücrelerin hızlıca çökelmesinde kullanılır. *Santrifüjleme sonunda tüpün dibinde hücreleri içeren çökeltiye ‘pellet’; çökeltinin üstündeki üst sıvıya ise ‘süpernatant’ adı verilir

Yüksek Hızlı Santrifüjler: *Daha duyarlı çalışmalarda kullanılan yüksek devirli ve ısı ayarı yapılabilen santrifüjlerdir. *Sıcaklığın (4°C veya dolaylarında) ve hızın kontrol altında tutulması, özellikle yüksek sıcaklığa duyarlı biyolojik materyallerin santrifüjlenmesi bakımından önemlidir. *Üç tip rotor kullanılır: sabit açılı, açılan kova veya dikey rotorlardır. *Bu sınıfta en çok kullanılan santrifüj tipi mikrosantrifüjler olup max. hızları 12.000-15.000 devir/dakikadır. *Bu tip santrifüjlerde, parçalamadan sonra hücresel artıklar yok edilebileceği gibi hücre organelleri ve kimyasal uygulamalar sonrasında makromoleküller çöktürülebilir.

Ultrasantrifüjler : *En gelişmiş santrifüj tipidir. *Çok yüksek devirlere ulaşabilmesi nedeniyle rotorda ısı artışı meydana gelir ve bu nedenle aletin içinin soğutulması gerekir ayrıca sürtünmenin engellenmesi için yüksek vakumda tutulması gerekir. *Ultrasantrifüjlerde tüplerdeki örneklerin dengeli olması için çok özen gösterilmelidir.

santrifüj