İnvaziv Olmayan Prenatal Tanı; Dolaşımdaki Serbest Fetal DNA’da Paternal Mutasyonların Belirlenmesi Uzm. Bio. Ebru Dündar Yenilmez Çukurova Üniversitesi, Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya ABD XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Sunu Akışı Tarihçe Günümüzde Kullanılan Prenatal Tanı Yöntemleri Maternal Fetal DNA ve Kullanım Alanları Maternal Fetal DNA’da paternal mutasyonların belirlenmesi Gelecekte Beklentiler Sonuç XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Tarihçe 1893-Fetal trofoblast Plazmada nükleik asit 1950-Genetik danışmanlık 1966-Amniyosentez 1969-Fetal lenfositler 1970-Koryonik vilüs örneklemesi 1980-Anne kanında Y kromozomu dizileri 1990-Fetal eritroblast Serbest fetal DNA XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Doğum Öncesi (Prenatal) Tanı Prenatal tanının başlangıcı, 1966’da Steele ve Berg’in bir fetüsun kromozom yapısının amniyotik sıvıdan alınan kültür yapılmış hücrelerin analizi ile belirlenebileceğini göstermesine dayanmaktadır. Genel amaç; Tedavisi mümkün olmayan fetal sağlık problemlerini gebeliğin erken döneminde belirleyip önlem almak ve risk taşıyan eşlere sağlıklı bir bebek için güvence vermektir. XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Günümüzde Kullanılan İnvaziv Prenatal Tanı Yöntemleri XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

İnvaziv Olmayan Prenatal Tanı Yöntemleri Fetal ultrasonografi Maternal kanda bakılabilen belirteçler İmplantasyon öncesi genetik tanı (PGD) Maternal plazmadaki serbest nükleik asitler; fetal hücreler, fetal DNA /RNA XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

İnvaziv Olmayan Prenatal Tanı XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Lo YMD ve ark. Lancet 1997 XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Klinik Tanıda Fetal DNA’nın Kullanım Alanları Fetal cinsiyet tayini Fetal RhD genotiplemesi Tek gen bozukluklarının saptanması Fetal DNA derişimini arttıran hastalıkların tanısı XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Tek Gen Bozukluklarının Saptanması Beta-talasemiler Miyotonik distrofiler Akondroplaziler Kistik Fibroz Konjenital adrenal hiperplazi Huntington hastalığı XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Yöntem 1- Örnek Toplanması ve Plazma Ayrımı Tıbbi Biyokimya AD’ye prenatal tanı için başvuran 89 beta talasemi taşıyıcısı gebeden 10 mL tam kan alınmıştır. Tam kanlar 1-2 saat içerisinde 5500 rpm 10 dk. santrifüj edilerek plazması ayrılmıştır. DNA izolasyonu için plazmalar -20 °C ‘de, bir kısmı da daha sonra kullanılmak üzere -70 °C ‘de saklanmıştır. XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Yöntem 2- Maternal Fetal DNA İzolasyonu Otomatik MagNA Pure DNA İzolasyonu Prensip; İzolasyon yöntemi manyetik boncuk teknolojisine dayanmaktadır. Ortama manyetik cam partiküller eklenir ve örnekte bulunan total nükleik asitler bu partiküllerin yüzeyine bağlanırlar. Saflaştırılan nükleik asitler düşük derişim tuz tamponu ile ayrıştırılır. XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

HRM Analizi DNA ikili ipliğinin ısı ile açılması sırasında herhangi bir baz değişimi varlığında, ortamdaki iki farklı floresan boyar maddenin de yardımıyla bu bölgelerde yaydıkları ışınımın anlık izlenmesiyle normalden farklı pikler oluşmaktadır. Bu pikler erime eğrisi olarak adlandırılmaktadır.

Yöntem 2- Beta Talasemilerde Erime Noktası Analizi (HRM) XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010 Her alele özgül amplikon için farklı sıcaklıklarda belirgin HRM eğrileri belirlenmiştir. Genotipi bilinen beta talasemi taşıyıcılarının genomik DNA’ları kontrol olarak kullanılmıştır. Örneklerin sonuçları ARMS, RFLP ve dizi analizi ile doğrulanmıştır. Mutasyonların taranması için kullanılan primerlerle beta geni 4 bölge olarak çalışılmıştır.

Beta Talasemilerde HRM ile Genotipleme 1.Promotor ve ekson 1 bölgesinin mutasyonlarının taranması Bu bölge için kullanılan primerler şu mutasyonları içermektedir; -101 (C → T), -87 (C → T), ‑ 30 (T → C), Cap+22 (G → A).

Beta Talasemilerde HRM ile Genotipleme 1. Bölge Promotor ve ekson 1 bölgesinin mutasyonlarının taranması -101 (C→T), -87 (C→T), ‑ 30 (T →C), Cap+22 (G→A). 2. Bölge 5′ UTR-Ekson 2 bölgesinin mutasyonlarının taranması IVSI-1 (G→A), IVSI ‑ 5 (G→A), IVSI-6 (T→C), IVSI-110 (G→A), Cd 15 (G→A), Cd 39 (C→T), Cd 44 (delC). 3. Bölge Ekson 2-IVS2 bölgesinin mutasyonunun taranması IVSII-1 (G→A) mutasyonu taranmaktadır. 4. Bölge IVS2-3’UTR bölgesinin mutasyonunun taranması Taranan mutasyonlar; IVSII-745 (C→G), IVSII-848 (C→A).

Baba ve fetal DNA’da IVSI-1 mutasyonunun HRM analizi ile görüntülenmesi.

Baba ile fetal DNA’da saptanan IVSII-1 (G→A) mutasyonu

Baba ve fetal DNA’da IVSII-848 mutasyonu HRM eğrisi.

Baba ve fetal DNA’da Cd 39 mutasyonu HRM eğrisi. Baba Fetal DNA

Geleneksel Yöntem ve HRM Sonuçlarının Karşılaştırılması AnneBabaCVSFetal DNA Cap +22/AIVSII-848/ACap +22/ IVSII-848 IVSI-110/ACd 15/AIVSI-110 / Cd /A -30/A* (2) Cd39/AIVS1-6/A HbASIVSI-110/AS/ IVSI-110S/ IVSI-110 (2) IVSI-110/AIVSII-1/AIVSI-110/ IVSII-1 IVSI-110/A IVSI-110/ IVSI-110 HbASCd 8/ AS/ Cd 8 IVSII-745/A AA FSC 22-24/A Cd 9-10/A Cd 9-10/A * HbASIVSII-1/A IVSII-1/A (3) HbASIVSI-110/A IVSI-110/A (14)

AnneBabaCVSFetal DNA HbAS HbAS * (23) HbAS AAAA (9) HbAS SS (7) Cd39/A Cd39/A (5) IVSI-110/ACd 8/ AIVSI-110/AIVSI-110/A* IVSI-110/A AAAA (2) IVSI-110/ACd 8/ AAAAA (3) HbASIVS1-6/AHbASHbAS* HbASCd 8/ AAAAA (4) Cd 8/ A Cd 8/ A* HbASCd 8/ AHbASHbAS* IVS1-1/A IVS1-1/A* (2)

Yöntemlerin Avantaj ve Dezavantajları İnvaziv Maliyet yüksek Zaman uzun Hasta stresli Düşük riski ≥11. hafta Mozaizm var *İatrojenik İnvaziv Olmayan Maliyet düşük Zaman kısa Hasta rahat Güvenli ≥6. hafta Mozaizm yok *İkiz gebelik *Dişi fetüs XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Gelecekteki Beklentiler… Tek gen bozukluklarının prenatal tanısının iyileştirilmesi –Serbest fetal DNA ekstraksiyonunun iyileştirilmesi –Daha iyi fetal belirteçler bulunması Fetal RhD durumunun erken tanısı için immünproflaksinin hedeflenmesi Anöploidi tanısı –RNA oranları –Epigenetik –Proteomik Obstetrik komplikasyonların yönetilmesinde dolaşımdaki fetal nükleik asitlerin ve proteinlerin rollerinin anlaşılması XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Sonuç-1 Gebeliğin 7. haftasından itibaren serbest fetal DNA fetal cinsiyet tayininde güvenilir bir testtir (doğruluk %98). Risk altındaki gebelerde invaziv prösedürlere olan ihtiyacı % 50’ye kadar azaltır. –KAH’de steroit tedavisini erken dönemde kesme –Fetal cinsiyetin belirlenmesinde fetal DNA, fetal ultrason veya invaziv testlere bir seçenek olarak önerilebilir. XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

Sonuç-2 Cinsiyetten bağımsız fetal belirteçlerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Fetal DNA genetik bozuklukların tanısında paternal mutasyonların belirlenmesinde kullanışlı bir seçenek yöntem Fetal DNA, fetal RHD in RHD- kadınların taranmasında kullanılabilir. XXII. Ulusal Biyokimya Kongresi Ekim 2010

TEŞEKKÜRLER…