MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II: SPEKTRAL YÖNTEMLER Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR 3.Ders

Çözeltideki total protein miktarının bilinmesi gereklidir: Protein veriminin belirlenmesi (materyal, yöntem açısından) Saflık kontrolü Deneylerin optimizasyonu Spesifik aktivite tayini ve saflaştırma derecesinin belirlenmesi (enzimler için)

KULLANILAN YÖNTEMLER ZOR , PAHALI duyarlılığı düşük, hata payı yüksek yöntemler Kjeldahl yöntemi (azot miktarının tayinine dayanır) Kızıl ötesi spektrometri Türbidimetri Fluorimetri Refraktometri Polarografi Amino asit analizine dayanarak (Asit hidrolizden sonra yapılır. Trp, Cys asit hidrolize duyarlı; Gln, Asn, asit forma dönüşür. Bunlar da hatalar yol açar)

UV ve GÖRÜNÜR ALANDA ABSORBSİYONA DAYANAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER Son yıllarda en çok kullanılan yöntemler: UV ve GÖRÜNÜR ALANDA ABSORBSİYONA DAYANAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER

OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ HAKKINDA KISA BİLGİ: ELEKTROMANYETİK IŞINLAR ile MADDE arasındaki etkileşimden yararlanan yöntemlerdir.

ELEKTROMANYETİK IŞIN NE DEMEKTİR?

ELEKTROMANYETİK IŞIN NE DEMEKTİR? Elektromanyetik Işın: Uzayda büyük bir hızla ilerleyen bir enerji

(lambda)= c/(nü) E = h x  İki önemli karakteri var: 1) Dalga karakteri: Uzayda sinüzoidal (dalga hareketiyle) yayılan elektrik ve manyetik vektörlere sahiptir. Madde ile etkileşiminde elektrik vektörü rol oynar. (lambda)= c/(nü) = Dalga boyu c= Işık hızı (3x1010 cm/sn)  = frekans (birim zamanda belli bir noktadan geçen dalga sayısı) 2) Tanecik karakteri: Bir ışın demeti çok sayıda tanecikten oluşur. Enerjili bu taneciklere FOTON denir. E = h x  h= Planck sabiti (6.626 x 10-34 j.sn)

MADDE-IŞIN ETKİLEŞİMİ Işının elektrik alanı ile maddenin bağ elektronları arasında gerçekleşir Maddenin yapısına göre değişir.

Madde ortamına giren ışın değişime uğrar: Doğrultusu değişir YANSIMA (REFLECTION) KIRILMA (REFRACTION)

Başka demetlere ayrılır: ÇİFTE KIRILMAYA UĞRAR (DOUBLE REFRACTION) SAÇILIMA UĞRAR (SCATTERING) KIRINIMA UĞRAR (DIFFRACTION)

Kutuplaşma düzlemi değişir: OPTİK ÇEVİRME Kutuplaşma derecesi azalır: DEPOLARİZASYON

Bu fiziksel değişimler maddenin enerji düzeylerinde herhangi bir değişime yol açmaz.

OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ Spektroskopik Olmayan Yöntemler TEMELİ: Işının YÖNÜNDEKİ veya FİZİKSEL ÖZELLİKLERİNDEKİ DEĞİŞİM ölçülür. Enerji düzeyleri arasında geçişler olmasını gerektirmez. Spektroskopik Yöntemler TEMELİ: Enerji düzeyleri arasındaki geçişler sonucu ortaya çıkan SPEKTRUM ölçülür.

Spektroskopik Olmayan Yöntemler Türbidimetri Nefelometri Raman Spektroskopisi Refraktometri İnterferometri X ışını Difraksiyonu Elektron Difraksiyonu Polarimetri ÖLÇÜLEN ÖZELLİK IŞININ SAÇILMASI IŞININ KIRILMASI IŞININ KIRINIMA UĞRAMASI IŞININ KUTUPLANMA ÖZELLİKLERİNİN DEĞİŞİMİ

Spektroskopik Yöntemler Spektrofotometri (UV-Visible, IR, X ışını) Kolorimetri Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi NMR Spektroskopisi ESR (Elektron Spin Rezonans) Spektroskopisi (Kütle Spektrometrisi) Emisyon Spektroskopisi Atomik Emisyon Spektroskopisi Fluoresan Spektroskopisi Radyokimyasal Yöntemler ÖLÇÜLEN ÖZELLİK IŞININ ABSORPLANMASI IŞININ YAYILMASI (EMİSYON)

Işının belli dalga boyları, madde tarafından ABSORBLANIR (SOĞURULUR, EMİLİR): ABSORBSİYON Bu enerji maddeyi (yani onu oluşturan atom veya molekülleri) UYARILMIŞ (EKSİTE) hale geçirir. X + h X* Düşük enerji düzeyi (ground: G ile de gösterilir) Yüksek enerji düzeyi (uyarılmış durum: S1 ile de gösterilir) Tanecik eski haline dönerken bu enerji ısı şeklinde geri verilir: X* X + ısı

Uyarılmış madde bir ışın yayabilir: EMİSYON X* X + h SPEKTROSKOPİK YÖNTEMLERİN TEMELİNDE ABSORPSİYON VE EMİSYON YATMAKTADIR. Bu olaylar enerji düzeyinde değişim yaratır.

Bir çözelti içindeki madde miktarını ölçmek için, çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanılır, bu tip ölçüm yapan cihazlara fotometre denir. Yani fotometreler, fotoelektrik kolorimetrelerdir. Fotometrelerde; hem ışığın tüm bölgelerinde (UV, görünür, IR) ölçüm yapılabilir, hem de renk yerine ışık ölçüldüğü için renksiz çözeltiler de ölçülebilir.

spektrofotometre Spektrofotometreler, maddenin renk yoğunluğunun ölçülmesiyle, madde miktarının veya konsantrasyonunun bulunmasını sağlayan cihazlardır. (Yöntem adı: Spektrofotometri)

YÖNTEMİN ADI: SPEKTROFOTOMETRİ ALETİN ADI: SPEKTROFOTOMETRE

Spektrofotometrenin komponentleri; Işık kaynağı Giriş yarıklı levhası monokromatör Çıkış yarıklı levhası küvet detektör Spektrofotometrenin komponentleri; Işık kaynağından çıkan dağınık ışıkları monokromatöre yönlendirir. Işık kaynağından gelen beyaz ışıktan uygun dalga boyunu seçip, diğerlerini elimine eder. Mercek veya prizma sistemidir Monokromatörden çıkan ışınlardan istenilen dalga boyundaki kısım geçirilir, diğerleri tutulur. Cam veya plastik numune okutma kaplarıdır. Küvetten geçen ışığın şiddetini ölçer. Döteryum (D2) lamba: UV ışık Tungsten (W) lamba: görünür ışık

Spektrofotometrenin çalışma prensibi: Lamba tarafından yayılan ışın demeti monokromatör (prizma) yardımıyla tek bir dalga boyundaki ışına (monokromatik ışına) dönüştürülür. Bu ışın örneğin içinde bulunduğu odaya girer. Ölçümü yapılacak örnek, KÜVET içine konulur. Görünür alanda çalışılıyorsa CAM (optik) KÜVET; UV’de çalışılıyorsa KUVARTZ (silika) KÜVET kullanılır. Örnekten geçen ışığın şiddeti dedektör tarafından algılanır ve kaydedici ya da yazıcıya elektrik sinyali şeklinde gönderilir.

Homojen bir absorblayıcı ortam Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io) daha küçüktür. Tabakaya gelen ışık Şiddeti: I0 Tabakadan çıkan ışık Şiddeti: I Homojen bir absorblayıcı ortam

Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir. Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak tanımlanır. Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir. I T = Io % T = x 100

Bir çözeltinin konsantrasyonu Absorbans (A) % transmittans Absorbans transmittansın negatif logaritmasıdır. Absorbans= optik dansite= A 1 I A= log = - logT = - log T Io

Lambert-Beer Kanunu Beer kanunu; Absorbans ve solüsyon konsantrasyonu arasındaki ilişkinin ifadesidir. Konsantrasyon arttıkça absorbans artar. Lambert kanunu; ışık yolu uzadıkça (solüsyonun derinliği arttıkça) absorbans artar. İkisi kombine edilerek bir eşitlik oluşturulmuştur.

Lambert yasası: Homojen bir absorplayıcı ortamdan geçen ışının şiddeti tabaka kalınlığının artması ile üssel olarak azalır: I = I0 x e-kd I = geçen ışının şiddeti I0= gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı d = tabakanın kalınlığı

Beer yasası: Işının şiddeti içerisinden geçtiği maddenin konsantrasyonuna bağlıdır. I = I0 x e-kc I = geçen ışının şiddeti I0= gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı c = konsantrasyon

Bu iki yasanın birleştirilmesiyle : I = I0 x e-kcd I = geçen ışının şiddeti I0= gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı c = konsantrasyon d = ışık yolu (sıvının içinde bulunduğu küvetin genişliği) I/I0 = e-kcd ln I/I0 = -k x c x d ln I0/I = k x c x d k x c x d log I0/I = k/2.303=  (epsilon) 2.303

log I0/I =  x c x d = A (Absorbans) veya E (Ekstinksiyon) Maddenin konsantrasyonu Işık yolu (cm) Absorpsiyon (veya Ekstinksiyon) katsayısı Konsantrasyonun (c) birimi g/l olursa, S, spesifik absorpsiyon katsayısı; Konsantrasyonun (c) birimi mol/l olursa, M, molar absorpsiyon katsayısı adını alır.

A; absorbans (birimi yok) l; solüsyonun derinliği (cm) A = ε.l.c A; absorbans (birimi yok) l; solüsyonun derinliği (cm) c; konsantrasyon (mol/L) ε; molar absorbtivite (L.mol-1.cm-1) ε; molar absorbtivite: 1 cm’lik ışık yolunda 1 mol/L’lik solusyonun absorbans değeridir.

Işık yolu (d) 1 cm olduğunda A yerine OPTİK DANSİTE (O. D Işık yolu (d) 1 cm olduğunda A yerine OPTİK DANSİTE (O.D.) terimi kullanılır.

Lambert-Beer yasasından sapmalar: NEDENİ: YÜKSEK KONSANTRASYON YANLIŞ DALGA BOYU SEÇİMİ uygunluk Negatif sapma Pozitif sapma Optik dansite Konsantrasyon

UV-Visible Spektroskopisi ve Lambert-Beer Yasası: Moleküler Biyolojide UV ve görünür ışınlar kullanılarak : Molekülün yapısı hakkında bilgi edinilebilir. (özellikle UV alandaki absorpsiyon önemlidir.) Konsantrasyon (derişim) belirlenebilir Kimyasal reaksiyonun gidişi izlenebilir. Enzim aktivitesi ölçülebilir.

Spektrofotometrik ölçümler iki farklı şekilde yapılabilir: Belli bir dalga boyunda absorbans ölçülür. Konsantrasyon veya absorbsiyon katsayısının belirlenmesine yarar. Belli bir dalga boyu aralığında absorbans taraması yapılır. Böylece ABSORPSİYON SPEKTURUMU elde edilir. Maddenin kimyasal karakteri hakkında bilgi sağlar.

Double-beam (Çift ışınlı spektrofotometrelerde ışın hem örnekten hem de kör örnekten (referans) geçirilir.

Microplate reader

SPEKTROFOTOMETRE vs MICROPLATE READER