Moleküler Floresans Spektroskopi

... konulu sunumlar: "Moleküler Floresans Spektroskopi"— Sunum transkripti:

1 Moleküler Floresans Spektroskopi

2 Moleküler Lüminesans Spektrometri
Lüminesans çeşitleri: i. floresans ii. fosforesans iii. kemilüminesans iv. biyolüminesans

3 Floresans ve Fosforesansın Teorisi:
s floresans s fosforesans e- hn absorplayarak uyarılır e- temel hale dönerken hn2 emisyon yapar hn2 kalitatif ve kantitatif analizler için kullanılır

4 Floresans – singlet hal - temel hale dönüş
Fosforesans – triplet- temel hale dönüş Floresans Fosforesans s s E Eşleşmemiş spinler Net manyetik alan Eşleşmiş spinler Net manyetik alan yok Moleküllerin elektron spin halleri. (a) Temel elektronik hal. En düşük enerjili veya temel halde, spinler daima eşleşmiştir ve bu hale temel singlet hal denir. (b) ve (c) Uyarılmış elektronik hallerdir.Uyarılmış halde spin eşleşmiş halde kalırsa, molekül uyarılmış singlet haldedir (b). Spin eşleşmemiş halde kaldığında ise, molekül uyarılmış triplet haldedir (c).

5 Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji

6 Gecikmiş Floresans Işımasız geçişler -IC 10-11-10-9 s
-ISC s Fosforesans s Floresans s Absorbsiyon s Sm Tm S1 T1 S0 Temel hal

7 Molekülün düşük enerji seviyesine veya temel hale dönüşünde titreşim, diğer moleküllerle çarpışma vb. nedenlerle ışımasız geçişler olur. Bu da molekülün absorpladığı enerjiden daha az emisyon yapmasıyla sonuçlanır.

8 Deaktivasyon Uyarılmış molekülün temel hale dönme işlemi Işımasız Deaktivasyon Fotonun emisyonsuz, ışımasız temel hale dönüşü

9 Farklı l’ları  farklı titreşim enerji seviyelerine çıkış
Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Terim: Absorpsiyon Etki: Uyarma İşlem: Analit molekülü fotonu absorplar (çok hızlı ~ – s); elektron üst enerji seviyesine çıkar. Farklı l’ları  farklı titreşim enerji seviyelerine çıkış

10 Terim: Titreşimsel durulma (vibratinal relaxation)
Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Terim: Titreşimsel durulma (vibratinal relaxation) Etki: Işımasız deaktivasyon İşlem: uyarılmış analit moleküllerinin diğer moleküllerle çarpışması  fazla titreşim enerjisini kaybetmesi daha düşük titreşim seviyelerine geçiş

11 Terim: İç dönüşüm (internal convertion) Etki: Işımasız deaktivasyon
Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Terim: İç dönüşüm (internal convertion) Etki: Işımasız deaktivasyon İşlem: Molekül daha düşük enerji seviyesine geçer– iki elektronik halin titreşim enerji seviyeleri çakışır ve molekül diğer elektronik seviyeye geçer

12 Terim: Dış dönüşüm (external conversion): Etki: Işımasız deaktivasyon
Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Terim: Dış dönüşüm (external conversion): Etki: Işımasız deaktivasyon İşlem: Uyarılmış haldeki analit moleküllerinin diğer moleküllerle çarpışması molekül temel hale foton emisyonu yapmadan döner.

13 Etki: Deaktivasyon, hn emisyonu
Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Terim: Floresans Etki: Deaktivasyon, hn emisyonu İşlem: fotonun singlet hale geçişi sırasındaki emisyon (kısa – uyarılmış hal ömrü~10-7 – 10-9 s).

14 Terim: Sistemler arası geçiş (intersystem crossing):
Etki: Işımasız deaktivasyon İşlem: Singlet halden triplet hale geçerken elektronun spin değiştirmesi. İki halin titreşim seviyeleri çakışırsa meydana gelir. Ağır atoma sahip moleküllerde gözlenir. (ör., I veya Br) Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji

15 Etki: Deaktivasyon, h‘de emisyon
Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Terim: Fosforesans Etki: Deaktivasyon, h‘de emisyon İşlem: Fotonun tripletten singlete dönerken yaptığı emisyon (uzun–uyarma hal ömrü~ 10-4 – 101s)

16 Kinin çözeltisinin uyarma ve emisyon spektrumu
STOKES SHIFT l1 l3 l2 Uyarma Emisyon Dalgaboyu, nm Bağıl şiddet Kinin çözeltisinin uyarma ve emisyon spektrumu

17 Jablonski Enerji Diagramı
S2, S1 = Singlet Haller T1 = Triplet Hal Rezonans ışıma - molekülün absorpladığı l’da emisyon yapması (emisyon = uyarma) Stokes kayması- molekülün absorpladığı l’dan yüksek l’da (düşük enerji) emisyon yapması ( emisyon >  uyarma)

18 Stokes kayması Uyarma Dalgaboyu, nm Bağıl şiddet Uyarma Emisyon
Emisyon Dalgaboyu, nm

19 Fosforesans: daha uzun dalgaboyu
Fenantren’in uyarma, floresans ve fosforesans spektrumları

20 Floresansı etkileyen faktörler
Kuantum Verimi (f): kuantum verimi = luminesans yapan moleküllerin sayısının uyarılmış molekül sayısına oranı lüminesans yapan moleküller f = uyarılmış moleküller

21 Floresans Kuantum Verimi
kec = dış dönüşüm (external conversion) (S1  S0) kic = iç dönüşüm (internal conversion) (S1  S0) kisc = sistemler arası geçiş (intersystem crossing) (S1  T1) kpd = predissociation kd = dissociation

22 Floresans ve Yapı Düşük enerji   * geçişi (aromatik): oldukça güçlü floresans 250 nm nin altında=> 140 kJ/mol birçok bağ kırılır - floresans gözlenmez s*  s - floresans gözlenir p*  p veya p*  n Konjuge çift bağ yapısı floresansı arttırır. Halka sayısının artmasıyla floresans artar. Yapının sağlamlığı (ör., naphthalen veya florene, bifenil) floresansı arttırır. Esneklik azaldığı için floresans artar. Sıcaklığın azalması moleküller arası çarpışmayı azaltacağından dış dönüşüm ve diğer ışımasız geçiş ihtimalleri azalır ve floresans artar. Floresans metale bağlı şelat ajanları olduğunda artar.

23 Floresans özelliği göstermeyen aromatik moleküller.
Floresans özelliği gösteren tipik aromatik moleküller.

24

25 Çözücü etkisi: Viskosite arttıkça floresans artar (dış dönüşüm ile ışımasız deaktivasyon azalacağı için) Ağır metal etkisi: I, Br, Th gibi ağır atomlar: sistemler arası geçiş artar, fosforesans artar.

26 pH etkisi: Rezonans yapılar artacağından kararlı uyarılmış hal ve kuantum veriminde artış
pH emisyon l’nu da etkiler (asit ayrışma sabitindeki değişim yüzünden) Anilinin rezonans formları Anilinyum iyonu

27 Çözünmüş O2 etkisi: - [O2] artışı florasans azalır - paramanyetik özellik sistemler arası geçişi (intersystem crossing) arttırır (spin flipping)

28 Işıkla parçalanma (Photobleaching): uyarılmış haldeki molekül diğer fotonu absorplar ve parçalanır  uyarılmış haldeki parçalanmış molekül floresans yapamaz

29 Floresans Şiddeti ve Analit Derişimi
F= 2.3K’ebcP0 F = Kc Floresans şiddeti derişimle doğrusal olarak değişir. Yüksek derişimlerde self absorpsiyon ve quenching nedeniyle doğrusallıktan sapma olur. Self absorpsiyon: Komşu molekül diğer molekülün yaptığı emisyonu absorplar – uyarma ve emisyon spektrumları çakışırsa gözlenir.(le = la) Quenching (sönme): Uyarılmış haldeki moleküllerin uyarılmış diğer moleküllerle çarpışması  ışımasız deaktivasyon

30 Derişimin Floresans ve Fosforesansa Etkisi
Düşük derişimde: F = 2.3K’ebcPo Yüksek derişimdeki sapma self-quenching veya self-absorption nedeniyledir. Derişim (µM) Floresans Şiddeti

31 Floresans Spektrofotometre
Tipik floresans cihazları. (a) Filtreli florometre. Floresans ışıması her yöne yayıldığı için, 90 derece tasarımı, dedektörün kaynağı görmesini engeller. (b) İki optik ağ monokromatörü ile donatılmış spektroflorometre. Burada da emisyon, 90 derece tasarımı ile ölçülür. İki monokromatör, uyarma spektrumunun (sabit bir emisyon dalga boyunda yayılan uyarma dalga boylarının spektrumu) taranmasını sağlar. Aynı tasarımla, emisyon spektrumu (sabit uyarma dalga boyunda yayılan dalga boylarının spektrumu) veya senkronize ışınlar spektrumu (iki monokromatörle, uyaran ve yayılan ışınlar arasında sabit bir dalga boyu farkı sağlanacak her iki spektrumun aynı anda kaydı) alınabilir.

32 Floresans Spektrofotometrelerin Bölümleri
Işık kaynakları Düşük basınçlı Hg lambaları 254, 302, 313, 546, 578, 691,773 nm çizgilerinde Yüksek basınçlı xenon ark lambaları (300 – 1300 nm) Lazerler Dalga boyu seçiciler Filtreler Monokromatörler Numune kapları Cam, kuartz hücreler Dedektörler - Fotoçoğaltıcı tüpler

33 Uyarma ve Emisyon Spektrumları
Uyarma spektrumu: Emisyon dalga boyu sabit tutulur, uyarma dalga boyu taranır. Monokromatör veya filtreler yalnızca floresans ışığın l’un geçmesine izin verecek şekilde seçilir Emisyon spektrumu: Uyarma dalga boyu sabit tutulup emisyon l taranır. Molokromatör veya filtreler yalnızca uyarma l’nun numuneden geçmesine izin verecek şekilde seçilir.

34 Bağıl şiddet Uyarma Emisyon Dalgaboyu, nm

35 Floresans Absorpsiyon
Duyarlılık ( ) Duyarlılık nano-femto molar ( M) mikro(10-6) M Dinamik aralık x Doğruluk, kesinlik Doğruluk, kesinlik (1-5 kat)

36 Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Fosforesans Yöntemi Fosforesans moleküllerin triplet halden temel hale dönerken yapmış olduğu emisyonun ölçümüne dayanır s sürer. Ortamda I, Br gibi ağır iyonların olması fosforesansı arttırır.

37 Fosforesans yöntemleri
Düşük sıcaklıkta fosforesans Numune organik çözücü içinde homojen olarak karıştırılarak sıvı azot ortamında dondurulur. Numune hücresi 1-3 mm iç çaplıdır. Daha büyük olursa donma homojen olmaz. 2) Oda sıcaklığında fosforesans a) Katı yüzeyden: Numune filtre kağıdı, polimer gibi katı yüzeye tutturulur. b)Çözelti ortamında Misel: Yüzey aktif maddenin içerisinde hapsedilir. Siklo dekstrin: Taç eterin kavitesine yerleşir. Ağır iyon etkili: Çözeltiye I, Br gibi ağır iyonlar eklenir.

38 MİSEL Hidrofilik Hidrofobik Hidrofilik uç Sulu çözelti Organik çözelti
Hidrofobik uç Sulu çözelti Organik çözelti

39

40 SİKLODEKSTRİN Hidrofobik iç yüzey İkincil yüzey Birincil yüzey

41 0.01M -CD (çizgi) ve 0.01 M -CD (noktalı çizgi) içerisinde5x10-5 M fenantrene ait emisyon spektrumu Dalga boyu (nm) Floresans Şiddeti

42 Kemilüminesans ve Biyolüminesans
Bir kimyasal reaksiyon, temel haline dönerken, ışık yayan veya enerjisini daha sonra emisyon yapacak başka türe aktaran elektronik olarak uyarılmış bir tür verdiğinde kemilüminesans meydana gelir. A+ B  C* + D C*  C + h Kemilüminesans olayı biyolojik sistemlerde de gözlenir. Bu olaya biyolüminesans adı verilir. Ateş böceği, deniz anası Numune Kabı Dalgaboyu seçici Dedektör Sinyal işlemci

43 Luminol+ H2O2

44 *Kemilüminesans oluşturan kimyasal reaksiyonlar az
*Belirli koşullarda oluşur ve alınan cevap her zaman aynıdır. *Dalga boyu seçicisi kullanımına gerek kalmaz *Dalga boyu seçicisi olmadığından numune ile dedektör daha yakındır *Seçici ve hassas bir yöntemdir.

45 Kemilüminesant reaksiyonların temel özellikleri
Ekzotermik Enerjinin kanalize edileceği tek olasılıklı reaksiyon olmalı Oluşan uyarılmış durumdaki molekül fazla enerjisini foton olarak vermeli

46 BİYOLÜMİNESANS Canlı organizmalarda enzim-substrat ilişkisine dayanan kimyasal reaksiyonlar sonucu oluşan emisyon olayıdır. Numune Kabı Dalgaboyu seçici Dedektör Sinyal işlemci

47 FLORESANS YÖNTEMİNİN DEDEKTÖR OLARAK KULLANIMI
Düzlemsel Kromatografi Madde doğal floresant Floresant olmayan türlerin uygun bir floroforla türevlendirilmesi Uygulanan plaka floresanttır.

48 Kolon Kromatografisi Türevlendirme; Kolon öncesi Kolon sonrası Pompa
Rezervuar Pompa Kolon Işık kaynağı Uyarma dalgaboyu seçici Dedektör Emisyon dalgaboyu seçici Atık Türevlendirme; Kolon öncesi Kolon sonrası

49 a) 8-hidroksikinolin ortama hangi amaçla eklenmiştir?
Derişimi bilinmeyen ve her biri 5 mL çinko numune çözeltisi içeren balonjojelere 1,5 ppm Zn2+ içeren stok çözeltiden aşağıdaki hacimlerde ilave edilmiştir. Daha sonra üzerlerine 8-hidroksikinolin’in aşırısı eklenerek hacimleri 50 mL’ye tamamlanmış ve floresans şiddetleri ölçülmüştür. Standart Zn2+ hacmi, mL Floresans Şiddeti 12,16 5 24,51 10 38,48 15 51,68 20 63,17 25 68,11 30 56,21 35 54,13 a) 8-hidroksikinolin ortama hangi amaçla eklenmiştir? b) Yüksek derişimlerde doğrusallıktan sapma nedenlerini açıklayınız. c) Kalibrasyon doğru denklemini oluşturunuz. d) Numune içerisindeki Zn2+ derişimini hesaplayınız.