İLAÇ ANALİZ TEKNİKLERİ

... konulu sunumlar: "İLAÇ ANALİZ TEKNİKLERİ"— Sunum transkripti:

1 İLAÇ ANALİZ TEKNİKLERİ
KROMATOGRAFİK YÖNTEMLER

2 KROMATOGRAFİ NEDİR ? Çok değişik sistem ve tekniğe uygulandığı için kromatografi teriminin tam olarak bir tanımını yapmak oldukça zordur. Bununla birlikte bu tekniklerin tümünde, ortak olarak sabit (durgun) bir faz ve bir de hareketli faz (gaz veya sıvı) bulunmaktadır. Akış halinde, gaz veya sıvı bir fazla birlikte karışımdaki bileşenler sabit bir faz üzerinden geçirilerek ve bileşenlerin göç etme hızlarına bağlı olarak ayrılma gerçekleşir. Bu işlem, göç etme hızlarındaki bu farklılıklardan dolayı, numune bileşenlerinin birbirlerinden kalitatif veya kantitatif olarak analiz edilebilen farklı bantlar veya bölgeler şeklinde ayrılmaları ile gerçekleşmektedir. Chroma: Renk Graphin: Yazmak

3 Bu bilgiler ışığında genel bir tanım yapmaya çalışırsak; kimyasal maddelerin sabit bir ortama ilave edilip, bunların belli bir çözücüyle yüzey adsorpsiyonu, dağılma, iyon değiştirme ve eleme özelliklerine bağlı olarak, bu sabit ortamdan ayrılma yöntemlerine kromatografi denilmektedir.

4 Kromatografik Metodlar
Sıvı Kromatografisi İyon Kromatografisi Gaz Kromatografisi

5 Kromatografi Türleri Sıvı-Sıvı Kr. Katı-Sıvı Kr. İnce Tabaka Kr.(TLC)
Kağıt Kr. İyon Kr. Gaz-Sıvı Kr.(GC) Gaz-Katı Kr. Yüksek Performans Sıvı Kr.(HPLC) Elektroforez; Kapiler Elektroforez 5

6 Birleştirilmiş Yöntemler
Gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi: GC-MS Gaz-sıvı kromatografide kolon sonuna ulaşan komponentler ulaşma süresine göre değil, kütlelerine göre belirlenir. LC-MS: HPLC de komponentler MS ile belirlenir. ICP-MS: ICP de örnekteki analit atomları kütlelerine göre belirlenir. Ayrıca HS-GC-MS, HPLC-ICP-MS ve LA-ICP-MS vb gibi tandem metotlar adli kimya laboratuvarlarında kullanılmaktadır. 6

7 KROMATOGRAFİ TÜRLERİ (Fiziksel olarak)
Düzlemsel (Planar) Kolon Gaz Kromatografisi (GC) Sıvı (Likid) Kromatografisi (LC) Kağıt Kromatografisi (PC) İnce Tabaka (TLC)

8 Kromatografik yöntemler fiziksel olarak da iki şekilde sınıflandırılabilmektedir: Kolon Kromatografisinde, sabit faz ince bir kolonda tutulur ve hareketli faz da basınç altında bu sabit faz arasından geçmeye zorlanır. Düzlemsel Kromatografi de ise sabit faz düz bir plaka üzerine veya bir kâğıdın gözenekleri arasına tutturulur ve bu durumda hareketli faz, sabit faz arasından kapiler veya yerçekimi etkisiyle hareket eder. Kolon kromatografik yöntemler de; sıvı, gaz ve süperkritik akışkanlı kromatografi olmak üzere üç kısımda sınıflandırılabilir. Böyle bir sınıflandırma, hareketli ve sabit fazların cinsine ve bileşenlerin iki faz arasındaki dengesine dayanır. Birinci kromatografi türünde hareketli faz sıvı, ikincisinde gaz ve üçüncüsündeyse bir süperkritik akışkandır.

9 Kromatografide hareketli faz olarak, su dâhil bütün organik çözücüler, bu çözücülerin çeşitli oranlardaki karışımları ve gaz veya süperkritik çözücüler kullanılabilmektedir. Hareketli fazda hiç çözünmeyen sabit faz olarak da, silikajel, alümina, kömür, florisil, kizelgur, poliamit, nişasta, talk vb. çeşitli gözenekli maddeler kullanılmaktadır. Kromatografide, numunelerin hareketli fazda ya da polaritesi daha zayıf olan bir çözücüde çözülmesi oldukça avantajlıdır. Hareketli fazlarda değişiklik yaparak daha iyi bir ayırım sağlanabilmektedir.

10 Mobil fazın türüne göre ikiye ayrılan kromatografi türlerinde:
1. Gaz Kromatografisinde, mobil faz gazdır. 2. Sıvı Kromatografisinde ise mobil faz sıvıdır.

11

12 Sıvı Kromatografisi (kolon, ince-tabaka ve HPLC’de kullanılan kromatografi türü)
Durgun Faz: silika, alumina, vs. Mobil faz (hareketli faz): organik solventler Önemli Özellikler: polarite Gaz kromatografisi Durgun Faz: genellikle bir kolonda yer alan alumina veya silika ve türevlerinden oluşmuş bir katı olabilir. Sabit fazın bileşimi, bir polimer veya wax (mum) tabaka olabilir. Örneğin; siyanopropilfenil dimetil polisiloksan, karbowax polietilen glikol, bisiyanopropil siyanopropilfenil polisiloksan. Eğer sabit faz, kizelgur gibi bir katı dolgu maddesi üzerinde tutulmuş uçucu olmayan bir sıvı filmi ise, yöntem "gaz-sıvı kromatografisi" adını alır. Film tabakasının kaynama noktası da yüksek olmalıdır. Mobil faz: gaz (genellikle Helyum) Önemli özellikler: kaynama noktası

13 Sıvı Kromatografisi Sabit fazın türüne göre sınıflandırılır:
1. Sıvı-Sıvı Kromatografisi: Sabit faz dolgu materyali üzerine yayılmış sıvı filmidir. 2. Sıvı-Katı Kromatografisi: Sabit faz katı dolgu materyalidir.

14 H igh P erformance L iquid C hromatography

15 H igh P ressure L iquid C hromatography

16 H igh P riced L iquid C hromatography

17 Sıvı kromatografisi (LC) yöntemleri arasında geniş bir uygulama alanına sahip olduğu için en fazla kullanılanı, yüksek basınçlı (performanslı) sıvı kromatografisidir (High Performance Liquid Chromatography). Klasik sıvı kromatografisinde, numune ve hareketli faz kolonun üstünden ilave edilir. Hareketli fazın kolondan aşağıya inmesi esnasında, numunedeki bileşenlerin bantlar halinde ayrılmaları sağlanır. Bantların iyi ayrılmamaları durumunda, daha uzun kolonlar kullanılır. Fakat böyle durumlarda da saatlerce beklemek gerekir. Alternatif olarak kolondaki dolgu maddesi inceltilse bile yine çok uzun süre beklemek gerekmektedir. Bunları gören bilim adamları, başka yollar araştırmışlar ve sonunda kolonu uygun büyüklükte dolgu maddesiyle doldurarak kolonunun üstünden yüksek basınç uygulayarak, çok daha iyi sonuçlar almışlardır. Böylece küçük dolgu maddeleriyle doldurulmuş yüksek basınç altındaki bir kolonda yapılan kromatografi türüne, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi yöntemi denilmiştir.

18 Niçin HPLC? Yöntem, son derece hassas olması, sıcaklığa karşı hassas olan maddelere bile uygulanabilmesi, doğruluk dereceleri ve kesinlikleri yüksek sonuçlar vermesi bakımından en çok kullanılan analitik ayırma yöntemleri arasında bulunmaktadır. Gaz kromatografisi yöntemi, sadece uçucu bileşiklere uygulanabildiği halde, HPLC yöntemi uygun çözücü, kolon ve dedektör kullanılması durumunda bütün bileşiklere uygulanabilmektedir. Ayırma işlemi, sabit faz ile hareketli (mobil) faz arasındaki göçe bağlı olduğundan, uygun bir hareketli ve sabit faz seçimi yapılarak, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi tekniği ile hem kalitatif hem de kantitatif analizler yapmak mümkün olmaktadır. Kalitatif analizde amaç, numune karışımı içindeki bir bileşiğin teşhisini yapmak olduğundan, maddelerin bilinen alıkonma zamanları ile karşılaştırma yapılarak analiz yapılabilir. Kantitatif analizde ise kromatografik sonuçlardan hareketle madde miktarının bulunması için bilinmeyen derişimdeki bir bileşiğin, bilinen bir çözelti içinde tanımlanması yapılmaktadır.

19 Yüksek Performans Sıvı Kromatografi yöntemi (YPSK veya HPLC) ilaçların kalite kontrol çalışmalarında ve değişik ortamlarda ilaçların miktar analizinde kullanılan yöntemler içerisinde de oldukça önemli bir yere sahiptir.

20

21 HPLC cihazının şematik olarak görünüşü

22

23 Kolonda ayrılan A ve B gibi iki maddenin kromatogramları
Kromatogram: Çözünen madde derişimlerine cevap veren bir dedektör, kolon çıkışına yerleştirilirse ve dedektör sinyali zamanın veya kullanılan hareketli faz hacminin bir fonksiyonu olarak kaydedilirse, bir seri pik elde edilir. Şekil de görüldüğü gibi, kromatogram olarak adlandırılan bu grafikler, hem kalitatif hem de kantitatif analiz için kullanılmaktadır. Bir kromatogramdaki pik sayısı, numunedeki bileşen sayısı kadardır. Kromatogramdaki zaman ekseni üzerindeki pikin yeri, onun hangi maddeye ait olduğunu, numune miktarı ile orantılı pikin alanı da, o bileşenin kantitatif ölçüsünü vermektedir. Kolonda ayrılan A ve B gibi iki maddenin kromatogramları

24 Kromatografik Ayrımın Amaçları:
Kantitatif Analiz: Pik alanı, pik yüksekliği esas alınır. Kalitatif Analiz: Numunenin tr’si, standardın tr’si ile karşılaştırılır. Preparatif Ayırma: Saflaştırma ve saf madde eldesi için kullanılır. 24

25 HPLC’nin İlaç Analizlerinde Kullanılması:
İlaçların kalitesinin ve güvenliğinin garanti altına alınmasında, Hem ilaç hem de olası safsızlıklarının tayin edilmesinde (gerek geliştirme gerekse üretim basamaklarının izlenmesi), Klinik öncesi ve klinik geliştirme fazlarında olası safsızlık profillerinin toksikolojik risklerinin dikkate alınarak incelenmesinde, İlaçların rutin analizi ve yeni ilaç moleküllerinin geliştirilmesinde, İlaçların değişik amaçlarla suiistimalinin saptanması ve engellenmesi alanındaki rutin analiz ve araştırma faaliyetlerinde, Doping kontrol ve adli analizlerde, İlaç-protein, ilaç-ilaç etkileşmeleri ile ilaç kullanımındaki uyumun izlenmesinde, İlaçların biyotransformasyonunda önemli yeri olan Faz I ve Faz II enzim tepkimelerinin izlenmesinde kullanılır.

26 HPLC için çalışma parametreleri
Ayırımın yapılacağı kolon Dedektör İsokratik & gradient çalışmanın şekli Çalışılacak dalga boyu Çalışma aralığı Mobil fazın bileşimi Akış hızı Enjeksiyon hacmi

27 HPLC’ de Etkileşim Tipleri
İyonik Etkileşimler Dipol Etkileşimler Hidrojen Bağı Dipol – İndüklenmiş Dipol Etkileşimi Dispers etkileşimler

28 HPLC ile ilaç analizlerinde önemli işlemler nelerdir?
Bir HPLC yöntemi için dört önemli işlem basamağı mevcuttur. Bunlar: Yöntem geliştirme (çalışma parametrelerinin belirlenmesi) Numune hazırlama, Yöntem geçerlilik testlerinin yapılması (validasyon) Standardizasyon (istatistiki hesaplama ve sonuçların değerlendirilmesi)

29 HPLC’de Yöntem Geliştirme
Kolon ve dedektör seçimi Numune hazırlanması Hareketli fazın seçilmesi ve programlanması Optimizasyon Metod validasyonu

30 Dedektör Seçimi: Numunenin kimyasal yapısına ve metodun gereksinimlerine bağlıdır. En çok kullanılan dedektör tipleri: UV Dedektör Diyote array Dedektör Floresans Dedektör Elektrokimyasal Dedektör

31 Kolon Seçimi: Tipik bir HPLC kolonunun çapı, 3-4 mm ve uzunluğu cm arasındadır. Dolgu maddesi olarak kullanılan silikajel parçacıklarının büyüklüğü ise 5-10 m’dir ve bu durum, sistemin performansını büyük ölçüde etkilemektedir. Basınca oldukça dayanıklı olan bu kolonlarda çok az miktarda çözücü ile oldukça kısa sürede ayırım yapılabilmektedir. Az çözücü kullanılması, son derece önemlidir. Çünkü, kromatografide kullanılan çözücüler çok saf ve pahalıdır. Kolonlar, genellikle oda sıcaklığında çalıştırılır. Ancak, bazı durumlarda daha iyi kromatogramlar elde etmek için kolonlar bir termostat içine alınmıştır. Bu termostatlar, oda sıcaklığından 150C’ye kadar olan sıcaklıklarda kolon sıcaklığını sabit tutarlar.

32 Bir kolonda ayırma prensipleri

33

34

35

36

37

38

39 Numune hazırlama: Ekstraksiyon Süzme (Filtrasyon) Türevlendirme

40 Numune hazırlama: Ekstraksiyon:
Bir çözelti yada süspansiyon içindeki organik maddeyi çözen fakat çözelti yada süspansiyondaki çözgen ile karışmayan bir başka organik çözgen yardımıyla ayırmaktır. Saflaştırma değil, ayırma yöntemidir. Filtrasyon: Kolon ömrünü arttırmak, enjeksiyon sisteminde sorunlarla karşılaşmamak için numuneler mutlaka filtre edilmelidir. Filtre yapısının numune ve çözücü ile uyumlu olmasına dikkat edilmelidir. Türevlendirme: Bazı numunelerde hassasiyeti arttırmak ve numunenin kendisinden kaynaklanabilecek kirlilik oranını düşürmek için türevlendirme gerekmektedir. Uygun bir reaktifle türevlendirilen madde floresan veya UV ışığını absorblar hale gelir.

41 Numune hazırlamada: Numune uygun bir çözücüde çözünmelidir veya seyreltilmelidir. Numune hazırlamada, en uygun çözücü gücü, mobil fazın gücüne eşit olandır. Analitik çalışmalarda analiz edilebilecek en düşük derişimlerde numune hazırlanabilmelidir. Çözücünün detektör cevabı, hiç yada çok az olmalıdır.

42 Numune hazırlarken, genellikle üç tip referans standart kullanılır:
1- Sertifikalı referans standartlar (yani USP onaylı standartlar) 2- İtibarlı bir ticari kaynaktan elde edilen, ticari olarak desteklenen referans standartlar 3- Bir analitik laboratuar ya da diğer ticari olmayan kaynaklar tarafından müşteriye göre sentezlenmiş diğer maddeler

43 Mobil Faz: Çok saf olmalı Filtrelerden geçirilmeli Degaze edilmeli (gaz giderici) Ağzı kapalı saklanmalı

44 Mobil Fazın Programlanması:
İzokratik Gradient Bir numunenin bileşenlerine ayrılması sadece sabit bileşimde tek bir çözücü (örneğin; hacimce % 50 etanol ve % 50 su) kullanılarak yapılırsa, buna izokratik elüsyon denir. Farklı polaritede iki veya daha fazla çözücü kullanılarak yapılırsa, buna da gradiyent elüsyon denir. Bu elüsyon türünde çözücünün bileşimi, programlanarak devamlı veya basamaklı olarak arttırılabilir. Bu şekilde, iki veya daha fazla çözücüden belirli oranlarda gelen hacimler bir sistemle karıştırılır.

45 HPLC’de Dikkat Edilmesi Gereken Noktalar
Doğru kesin çalışan pompa Uygun HPLC kolonu Dar boru sistemi seçilmesi Boru sisteminin kısa tutulması Sıcaklık kontrolü

46 HPLC’deki Temel Parametreler:
Alıkonma Zamanı (Retention Time), tr Alıkonma genellikle kapasite faktörü ile (k’) ile ifade edilir. k’ = tr – to / to tr : Alıkonma zamanı to : Alıkonmayan maddelerin kolonu terk etmeleri için gereken zaman (ölü hacim)

47 Etkinlik (teorik plaka sayısı)
W, bant (pik) genişliği

48 HPLC’deki Ayırma Teknikleri: 1-Dağılma (Partisyon) Kromatografisi
Normal faz: Sabit faz polar Mobil faz apolar Ters faz: Sabit faz apolar Mobil faz polar

49 Normal Faz: Polaritesi yüksek olan maddeler, polar olan sabit faz ile daha fazla etkileşir ve kolonu daha geç terk eder. Normal Faz Dolgu Materyalleri: Silika jel üzerine –CN, -NO2 veya –NH2 polar fonksiyonel fazlar bağlanmıştır. Mobil Faz: Zayıf çözücü n-Hekzan, kuvvetli çözücü Metil-t-butileter, Metilenklorür ve Asetonitril vs.

50 Ters Faz: Sıvı kromatografisi ayrımlarının %75‘ten fazlasında kullanılır. Alkil fonksiyonel gruplu karışımların ayrılmasında tercih nedenidir. Dolgu materyalleri: En iyi ayırımlar, silika jel üzerine bağlanmış, C18H37 gruplarına sahip C18 kolonlarıdır. Mobil faz: Su ve organik çözücü karışımlarıdır.

51 2-Adsorpsiyon Kromatografisi
Sıvı kromatografisi tarihinde ilk geliştirilen ayırma tekniğidir. Bazı maddelerin katı polar bir maddenin yüzeyine fiziksel olarak bağlanmasıyla gerçekleşen bir prosestir. Temel uygulamaları, organik çözücülerde çözünen farklı polaritedeki maddelerin ayrılmasıdır. HPLC de kullanılan durgun faz bir katı olduğunda, bu faz ile sıvı mobil faz arasındaki bu denge tipi, adsorbsiyon olarak adlandırılır. Yaygın olarak kullanılan adsorbanlar silika ve alumina dır. Silikanın yüzeyi silanol grupları ile kaplıdır.

52 Silikajel geniş gözenek çapında, amorf yüksek kısmı basınç altında yüksek nem adsorbsiyon kapasitesine sahip silisyumdioksittir.

53 Durgun faz: Silika (SiO2)

54 Durgun faz: Alumina Asidik: -Al-OH Nötral: -Al-OH + -Al-O- Bazik: -Al-O- Alümina (Al2O3), özellikle absorpsiyon koşullarında bir çok gaz ve sıvıların içindeki nemi ve diğer safsızlıkları almak için kurutucu olarak kullanılan üstün yüzey özelliklerine sahip bir absorbandır.

55 3-İyon Çifti (İyon Pair) Kromatografisi
İyonize olan maddeler, ters faz tekniğinde, iyonize oldukları için, kolonda ya hiç yada çok az alıkonurlar. Bu teknikte, hareketli faza iyon çifti reaktifi ilave ederek, iyonlaşan maddelerin alıkonma süreleri arttırılır. Hareketli faza ilave edilen iyon çiftleri, polaritesi düşük olan sabit faz tarafından absorplanır. İyonize olmuş maddeler, bu iyon çiftleri ile iyonik etkileşime girerek kolonda alıkonurlar. Maddelerin alıkonmaları, ilave edilen iyon çifti reaktifinin konsantrasyonu ile değişir. Dolgu materyalleri: sabit fazlar, C18, C8 dir. Mobil Faz: Organik çözücü olarak metanol kullanılır. Tamponlar: 0,02-0,2 M’lık

56 4-İyon Değiştirme Kromatografisi
İyonik bileşikleri ayırmak için kullanılır. İnorganik iyonların, proteinlerin, peptidlerin ve amino asitlerin ayırımı için oldukça uygundur. İyon değiştirme mekanizmasında hareketli fazın pH’ı ve iyonik gücü, alıkonma süresi üzerinde, hareketli fazın organik çözücü içeriğine oranla daha fazla etkilidir. İyonik etkileşim gücü artan atomik ağırlıkla doğru orantılıdır. Dolgu maddeleri silika jel üzerine iyonik fonksiyonel grupların bağlanması ile elde edilir. Negatif yüklü fonksiyonel gruplu dolgu maddeleri katyon değiştiricileri; pozitif yüklü fonksiyonel gruplu dolgu maddeleri anyon değiştiricileri olarak adlandırılır.

57 5-Boyut Eleme Kromatografisi
Eleme kromatografisi, molekül ağırlık farkı çok büyük olan bileşikleri içeren karışımları ayırmak için kullanılır. Eleme kromatografisinde sabit faz yüzeyi ile etkileşim olmamaktadır. Dolgu maddesinin por (gözenek) büyüklüğü ve numunede bulunan moleküllerin boyutu alıkonma süresini etkiler. Büyük moleküller porlara sığmayarak hareketli faz ile birlikte hızla sürüklenerek kolondan ilk önce çıkarlar. Küçük moleküller, porları dolduran hareketli faza difüze olurlar. Bunların ortalama hızları, porlarda geçirdikleri zaman miktarına bağlıdır. Orta büyüklükteki moleküller ise sadece bazı porlara difüze olurlar, bu nedenle ortalama bir hızla hareket ederler.

58 6-Jel Geçirgenlik ve Jel Filtrasyon Kromatografisi:
Eleme kromatografisinde hareketli faz olarak organik çözücü kullanıldığında GPC (Jel Geçirgenlik), hareketli faz olarak sulu çözeltiler kullanıldığında GFC (Jel Filtrasyon) olarak adlandırılır. Hareketli fazların seçiminde maddelerin hareketli fazdaki çözünürlüğü dikkate alınır. GPC’de en çok kullanılan hareketli faz THF’dır, sonra toluen, metilen klorür ve DMF’de (dimetil formamid) kullanılmaktadır.

59 HPLC’de Kantitatif Analizde Kullanılan Metotlar:
Sıvı kromatografisinde, kromatogramdaki piklerin alanı ya da yüksekliği, miktar tayini yapılacak maddenin konsantrasyonu ile doğrusal bir ilişki içinde olduğu zaman (yani dedektör cevabı ile konsantrasyon arasında doğrusal bir ilişki olması halinde) üç yolla miktar tayini yapılmaktadır: Eksternal (dış) standart yöntemi İnternal (iç) standart yöntemi Standart ilavesi yöntemi

60 Eksternal standart analiz yönteminde, referans standardın bilinen konsantrasyonlarda standart çözeltileri hazırlanarak, alınan cevap, pik yüksekliği veya pik alanına göre tayin edilir. Bilinen miktarların cevabına karşı numunenin cevabından bir kalibrasyon eğrisi çizilerek, bilinmeyenin pik alanından miktara geçilerek tayin gerçekleştirilir. Piklerin zaman eksenindeki konumları numunedeki bileşikleri tanımak yani kalitatif tayin için, piklerin altındaki alanlar ise her türün kantitatif tayini için kullanılır.

61 İnternal standart analiz yönteminde ise numune içinde olmayan, iyi karakterize edilmiş, saf ve kararlı olan bir bileşik, standart çözelti ve numune içine katılır. Daha sonra, internal standart ve analitin cevap oranı bulunarak, miktar oranına göre grafik edilir. Kullanılan internal standardın kimyasal ve fiziksel özellikleri, tayin edilecek bileşiğe yakın olmalı ve bu bileşik, diğer bileşiklerin piklerinden tamamen ayrı bir pik vermelidir. Aanalit/Aiç standart

62 (internal standart) diazepam karbamezapin 2,30 Örneğin; Diazepam internal standardı kullanılarak, karbamezapin miktar tayini yapılmış, 1 ml’sinde 15 µg karbamezapin içeren çözeltinin konsantrasyonu 15,0332 µg olarak bulunmuştur. 4,02 Waters model HPLC cihazı, µ-Bondapak CN (RP) kolonu, Asetonitril-su (30:70, v/v) mobil faz, UV-DAD dedektörü 254 nm’de, 25 µl enjeksiyon hacmi, 0,8 ml/dk 62

63 Standart İlavesi Yönteminde, aynı miktarda alınan numunelere, artan derişimlerde standart çözelti ilave edilir. İlk numune çözeltisine ilave yapılmaz. Bu çözeltilerin cihazla sinyalleri ölçülür. Numune çözeltisi hepsinde bulunduğundan ortam yaklaşık olarak aynıdır. Doğrunun X eksenini kesim noktasından numunedeki analit derişimi bulunur veya hesaplanır. Ortam etkisinin olduğu, karmaşık numunelerin analizinde genellikle Standart Ekleme Yöntemi kullanılır.

64 Bir ya da iki maddenin analizi için uygulanabilen bu yöntemde, önce örnek sisteme enjekte edilir, sonra analizi istenen maddenin referans standardının belli bir miktarı ilave edilip, enjeksiyon yapılır ve pik alanı (ya da yükseklik) farkından miktar tayinine geçilir.

65 HPLC'nin Eczacılık Alanında Kullanımı:
İlaç etken maddesinin hızlı, duyarlı ve güvenilir analizini yapmaya yarayan bir yöntemdir. Bu yöntemle saflık ve kalite kontrolü, stabilite tayini ve reaksiyon sırasında reaksiyon ara ve sonuç ürünlerinin saptanması ile ayırımlar sağlanabilmektedir. Biyolojik materyallerde ilaç ve ilaç metabolitlerinin analizine de olanak sağlayan bu yöntemde, plazmadaki ilaç düzeyinin saptanması, doz ayarlanması ve biyoyararlılık gibi konularda çalışmalar yapılabilmektedir.

66 Örnek: Aspirin tabletlerinde, safsızlık olarak salisilik asit, asetilsalisililsalisilik asit, asetilsalisilik asit anhidridi ve salisililsalisilik asit bulunabildiği, aspirin üzerinde yapılan bilimsel çalışmalar sonucunda ortaya çıkarılmış olduğundan, bu safsızlıkların aspirin yanında teşhisi bakımından bu kromatogram, iyi bir örnek oluşturmaktadır.