UV-Vis. SPEKTROSKOPİK İLAÇ ANALİZ YÖNTEMLERİ

... konulu sunumlar: "UV-Vis. SPEKTROSKOPİK İLAÇ ANALİZ YÖNTEMLERİ"— Sunum transkripti:

1 UV-Vis. SPEKTROSKOPİK İLAÇ ANALİZ YÖNTEMLERİ

2 Temel ilkeler Tüm spektroskopik analizler, madde çözeltisinden geçen enerji miktarı ile madde içermeyen çözücüden geçen enerji miktarının karşılaştırılması ilkesine dayanır. Spektrometri’nin esası, bir örnekteki atom, molekül veya iyonların, elektromanyetik radyasyonla (ışımayla) çeşitli şekillerde etkileşiminin (absorpsiyon, emisyon, floresans, kırılma indisi, yansıması, saçılması vb.) kalitatif veya kantitatif olarak ölçülmesi ve yorumlanmasıdır.

3 Elektromanyetik Işıma
Uzayda çok büyük hızla hareket eden bir enerji türü olan elektromanyetik ışımanın en çok karşılaşılan türleri, gözle algıladığımız görünür ışık (vis-) ve ısı şeklinde algıladığımız infrared (IR) ışınlarıdır.

4 Elektromanyetik ışıma, uzayda bir düzlemde çok büyük hızla dalgasal olarak hareket eden elektriksel alan vektörleri ile buna dik düzlemde aynı fazda ilerleyen manyetik alan vektörlerinden oluşan bir enerji türüdür. Elektromanyetik ışıma, hem dalga hem de tanecik özelliğine sahiptir. Yani, elektromanyetik ışımanın dalga ve tanecik olarak davrandığı ispatlanmıştır. İnterferans (girişim) ve difraksiyon (kırınım) davranışları ışımanın dalga özelliğiyle açıklanır. Bir metal yüzeyinden ışıma ile elektronların koparılması (fotoelektrik olay), ışıma enerjisinin bir madde tarafından absorpsiyonu (soğurulması) ve emisyonu (yayılması) olayları da ışımanın tanecik özelliği (foton) ile açıklanır. Ancak ışın enerjisinin absorpsiyonu ve emisyonu ile ilgili olayların açıklanmasında dalga modeli başarılı olamamıştır. Bunun için tanecik modeli geliştirilmiştir. Bu modelde elektromanyetik ışın, enerjileri frekansıyla orantılı olan ve foton adı verilen parçacıklar veya enerji paketlerinden oluşmuş olarak görülür. düğüm

5 Işın enerjisi ve dalga parametreleri
Dalgaboyu (l): İki tepe noktası arasındaki mesafedir. Frekans (n): Bir saniyede belirli bir noktadan geçen dalga sayısıdır. E = h.n = h. c/ l h: Plank sabiti = 6,62x10-27 erg.s n : Frekans (tit/s) l : Dalgaboyu (cm, nm, A0, ..) E 1/ l E n c = 3 x 108 m/s (vakumda)

6 Elektromanyetik ışıma-Madde etkileşmeleri:
-Işımanın kırılması ve yansıması -Işımanın saçılması -Işımanın polarizasyonu -Işımanın absorpsiyonu ve emisyonu

7 Işının Bir Ortamdan Geçerken Yavaşlaması
Işın bir ortamdan geçerken madde elektronları ile çarpışarak geçici olarak alıkonur ve hızı azalır. Bu sırada frekansı değişmediği için dalga boyu azalır. Işının bir ortamdaki hızı ortamın cinsine ve konsantrasyonuna bağlıdır ve bu özellik refraktif indis ile verilir: n = c/v

8 Işının Geçmesi ve Kırılması
Saydam bir ortamdan geçen ışının hızı, o ortamda bulunan atom, iyon veya moleküllerin tür ve derişimine bağlı olarak, boşluktaki hızına göre daha düşük bir hızla yol alır. Bu gözlemlerden yola çıkarak, ışının madde ile herhangi bir şekilde etkileşimde bulunduğu anlaşılır. Ancak bu sırada ışının frekansında bir değişme olmadığı için, etkileşimde kalıcı bir enerji aktarımı söz konusu olmaz. Kısaca, bir ortamın kırma indisi, ortamın ışınla etkileşiminin bir ölçüsüdür.

9 Işımanın kırılması ve yansıması
Işıma bir ortamdan ikinci bir ortama geçtiğinde kısmen yansır, kısmen de ikinci ortama geçer. İkinci ortamda ilerleyen ışımanın frekansı değişmez, ilerleme yönü ve hızı değişir. Işık demetinin bir ortamdan yoğunluğu farklı başka bir ortama geçerken yön değiştirmesine kırılma (refraksiyon) adı verilir. Kritik açının ölçülmesiyle her madde için farklı kırılma indisi belirlenmiştir.

10 Sin(i)/Sin(r)= V1/V2= n2/n1

11 Işının Yansıması Işın, kırma indisleri farklı iki ortamın ara yüzeylerindeyken yansır. Işının yansıma oranı, kırma indislerinin farkıyla artar. Ara yüzeye dik açıyla gelen ışın demeti için yansıma oranı aşağıdaki bağıntıyla verilir. Yansıma derecesi = Ir yansıyan ışın , Io ise gelen ışını temsil eder. Gelen ışın ile kırılan ışın arasında aşağıdaki bağıntı: 1Sin2 = 2Sin 1 1 2 Örnek: Havanın kırma indisi 1, camın ki 1,5 olduğuna göre dik olarak cama gelen ışığın yansımasını hesaplayınız. Ir/Io= (1,5-1)2/(1,5+1)2 = 0, % 4 yansır.

12 Kırılma indisi değerleri, maddelerin belirgin özelliklerinde biri olarak tanımlanmıştır. Kırılma indisinin ölçülmesine dayanan refraktometri yönteminde, maddelerin kırılma indisi değerleri, maddenin nitel analizinde, saflık derecesinin belirlenmesinde ve karışımların nicel analizinde kullanılmaktadır. Kırılma indisi ölçümü yapan düzeneğe de refraktometre adı verilir.

13 Işımanın saçılması Fotonun örnekteki parçacıklara çarparak yön değiştirmesine de saçılma adı verilir. Madde içinden ışının geçişi, ışın enerjisinin atom, iyon veya moleküller tarafından bir anlık tutulması ve sonra parçacıklar, ilk haline dönerken her yöne yayılması olarak düşünülebilir. -Görünür bölge ışıması kullanıldığında, kolloidal ve bulanık çözeltilerde gözlenen saçılma, Tyndall saçılmasıdır. -Çözünmüş moleküller veya çok atomlu iyonların saçılması Rayleigh saçılmasıdır. -Parçacıklarla etkileşen dalga boyunun, ışığı saçan moleküllerin titreşim enerji düzeylerine göre değiştiği saçılma türü Raman saçılmasıdır.

14 Işının Polarizasyonu Işık dalgası, genellikle her düzlemde ilerleyen dalgaların bir karışımıdır. Işığın yayılımı rastgeledir, yani ışık yayılırken her yönde titreşim gösterir. Polarize olmayan ışıktan polarize ışığın elde edilmesinin bir yolu yansımadır. Tek bir düzlemde ilerleyen ışık dalgasına düzlemsel polarize ışık denir. Normal olarak ışın, gidiş yolu merkez olmak üzere bu yolun etrafında eşit olarak dağıtılmış çok sayıda düzlemde yol alan bir demet elektromanyetik dalgadan oluşur. Düzlemsel polarize ışık ise yayılma yönüne dik olan tek bir düzlemde titreşen ışıktır. Bu ışık ile ışığı absorplamayan asimetrik maddeler etkileştiği zaman, polarize ışığın düzlemi sağa (+) veya sola (-) açı değiştirir. Maddelerin ışıkla etkileşmelerini gösteren bir alet olan polarimetre, polarize edilmiş bir ışığın bir madde içerisinden geçirilmesi ile değişimleri ölçen bir cihazdır. Polarize ışığın yönünü hiç döndürmemesi, bu maddenin optikçe aktif olmadığını gösterir. Polarize ışığı sağa ve sola çeviren maddeler asimetrik C atomuna sahip, optikçe aktif maddelerdir.

15 Işımanın absorpsiyonu ve emisyonu
Kuantum kuramına göre atomlar, ancak elektron konfigürasyonuna ve dış elektronlarının belirli enerji düzeyleri arasındaki geçişlerine bağlı olarak belirli potansiyel enerji düzeylerinde bulunabilirler. Elektronların bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri ile ilgili atomik spektrumlar incelenmiştir. Atomlar, elektromanyetik ışımayı absorbe ederek, en düşük enerji düzeyinden (temel düzey) uyarılmış düzeylere geçerler; bu geçişlerle ilgili olarak söz konusu atomların absorpsiyon spektrumları belirlenmiştir. hPlank sabiti (6,63x10-34), frekans olmak üzere; E = h. 

16 Elektromanyetik ışımayı absorbe ederek, en düşük enerji düzeyinden (temel düzey) uyarılmış düzeylere geçmiş olan atomlar, temel düzeye dönüş sırasında ultraviyole veya görünür bölge sınırları içinde ışıma enerjisi yayarlar (emisyon). Her atom için bir emisyon spektrumu böylelikle belirlenir. Moleküller de atomlarda olduğu gibi uygun enerjideki fotonlarla etkileştiklerinde, bu fotonları absorplayarak uyarılmış hale geçerler. Uyarılmış moleküller, bu kararsız durumdan fazla enerjilerini yayarak kurtulurlar (moleküler emisyon). Atom spektrumlarından daha karmaşık olan moleküler spektrumlar da böylelikle belirlenir.

17 Elektromanyetik Spektrumda Bölgeler

18 Absorplanan fotonların sayısı, ortamdaki absorpsiyon yapan türlerin sayısı ile orantılıdır. Monokromatik ve I0 şiddetindeki bir ışıma, ortamı daha küçük olan I şiddetinde terk eder. Lambert-Beer kanunu: Bir çözeltiden geçen ışık miktarı, ışığın çözelti içinde kat ettiği yol ve çözelti konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı, emilen ışık miktarı ile ise doğru orantılıdır.

19 % Geçirgenlik (%T) =100 .T = 100. I/I0 Absorbans = - log10T
Geçirgenlik (T) = I/I0 % Geçirgenlik (%T) =100 .T = 100. I/I0 Absorbans = - log10T Absorbans (A)=   b c cçözelti konsantrasyonu (mol/L) bışığın çözelti içinde kat ettiği yol (cm) molar absorpsiyon katsayısı (L/mol cm-1)

20 Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır. Bu ışınlar, saydam maddeler için maddenin içinden geçip gelen, saydam olmayanlar için ise yansıyan ışınlardır. Madde tarafından tutulan ışınların rengi ile maddenin görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler olarak adlandırılır: Sarı-Mavi, Kırmızı-Yeşil gibi.

21 Işık  (nm) Absorbe edilen renk Görünen renk - Menekşe Sarı-yeşil Mavi Sarı Yeşil-mavi Portakal Mavi-yeşil Kırmızı Yeşil Mor

22 Çözelti içindeki madde miktarını çözeltinin renginden faydalanarak ölçme işlemine ise kolorimetri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da kolorimetre denir. Kolorimetrik ölçümde, konsantrasyonu ölçülecek çözeltinin rengi değişik konsantrasyonlardaki standartların rengiyle karşılaştırılarak değerlendirilir.

23 Kolometrik analizde kullanılan cihazlar spektrofotometrelerin çalışma prensibiyle aynıdır. Farklı olarak, prizma yerine filtre vardır. Filtreden geçen ışığın dalga boyu bellidir. Kolorimetrelerle görünür bölgede (= nm) çalışılır. Madde renkliyse, direkt yöntemlerle çalışılır. İndirekt yöntemde ise madde renkli bir türevine dönüştürülür.

24 Spektroskopik yöntemler
Ultraviyole-görünür bölge absorpsiyon spektroskopisi Floresans ve fosforesans spektroskopisi Atomik absorpsiyon spektroskopisi Atomik emisyon ve atomik floresans spektroskopisi İnfrared (IR)spektroskopisi Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi Kütle spektrometrisi

25 Ultraviyole-görünür bölge absorpsiyon spektroskopisi
Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri, bu tip bir ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir. Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da ölçülebilir.

26 Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak gönderen ve ayıran aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler ise spektrofotometre olarak adlandırılırlar.

27 Maddenin ışığı absorplamasını incelemek için kullanılan düzeneğe absorpsiyon spektrometresi veya absorpsiyon spektrofotometresi adı verilir. Bir spektrofotometre düzeneği, başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi (monokromatör) ve dedektörden oluşur. Dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal, bir kaydedici ile ölçülür.

28 UV-görünür bölgede D2, W, H2, Xe, civa buhar lambası gibi sürekli ışık kaynakları kullanılır.
Tungsten (volfram) flaman lambası, görünür ve yakın IR bölgede ( nm) ışık yayar. Ulraviyole bölgede en çok kullanılan lambalar, hidrojen ve döteryum elektriksel boşalım lambalarıdır. Bu lambalar nm arasında ışık yayar. Xe ark lambası, UV-görünür bölgenin tümünde ( nm) kullanılabilecek şiddetli ve sürekli ışık kaynağıdır. Civa buhar lambası, her iki bölgede ışıma yapabilen bir ışık kaynağıdır; sürekli spektruma ek olarak kesikli hatlar da içerir.

29 Dalga boyu seçicileri (monokromatörler), ışık kaynağından gelen polikromatik ışıktan tek bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini gerçekleştiren düzeneklerdir. Monokromatör, filtreli fotometrelerde ışık filtresidir; spektrofotometrelerde ise ışık prizmasıdır.

30 Spektrofotometrelerde dedektör, maddenin ışığı absorplayıp absorplamadığını anlamak için ışık kaynağından gelen ışığın şiddetinin ölçülmesi amacıyla kullanılan düzenektir.

31 Spektrofotometre ile bir maddenin nicel analizinin yapılacağı dalga boyunu kararlaştırmak için, örneğin absorpsiyon spektrumunu bilmek gerekir. Bunun için, maddenin 1 molar çözeltisinin çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür. Çözücünün ve çözeltide bulunan başka türlerin ışığı absorplamadığı, Lambert-Beer eşitliğine uyulduğu ve nicel analizin en duyarlı biçimde yapılabileceği dalga boyu değeri saptandıktan sonra, analizi yapılacak maddeyi içeren ve derişimleri bilinen bir dizi standart çözelti ile bu dalga boyundaki absorbans (A) değerleri ölçülür. A değerleri, standart çözeltilerin bilinen derişimlerine karşı grafiğe geçirilir.

32 Standart çözeltilerin bilinen derişimlerine karşı A değerlerini grafiğe geçirmek suretiyle elde edilen doğruya kalibrasyon doğrusu denir. Nicel analiz, kalibrasyon doğrusunun doğrusal olduğu bölgede yapılır. Derişimi bilinmeyen örneğin A değeri ölçülür ve kalibrasyon doğrusunda bu değere karşılık gelen derişim saptanır. X Molar absorpsiyon katsayısının değerinin bilindiği durumlarda, Lambert-Beer eşitliğinin analizde doğrudan kullanılması da mümkündür. Absorbans (A)=   b  c

33 Absorpsiyon spektroskopisi kantitatif analizde de çok kullanılır
Absorpsiyon spektroskopisi kantitatif analizde de çok kullanılır. Absorbansın tayini için seçilen dalga boyu, maddelerin ışığı en fazla absorbladığı dalga boyu olup, bu değere max denir. Bu dalga boyunda hassas ölçümler yapılabilir. Absorbansın en fazla olduğu değere karşı gelen değer, max’ı verir. Bütün çalışmalar bu dalga boyunda yapılır. max değerinin saptanmasında maddenin belli konsantrasyondaki ( M gibi) çözeltileri hazırlanıp, dalga boyu değişmesine karşı absorbanslar ölçülür ve bu değerler grafiğe geçirilir. Bir maddenin dalga boyu ve sıcaklığı sabit tutularak, değişik konsantrasyonlarda absorpsiyonu, ölçülür. Absorbansa karşı konsantrasyon eğrisi çizilirse, genellikle bir doğru elde edilir. Konsantrasyonu bilinmeyen maddenin, saptanan max’da absorbansı ölçülür ve daha önce çizilmiş Beer eğrisinden yararlanarak konsantrasyonu saptanır. Bir başka çalışma şeklinde ise aynı maddenin standardının, konsantrasyonu bilinen çözeltisi hazırlanarak absorbansı ölçülür. Daha sonra konsantrasyonun bilinmeyen maddenin de absorbansı ölçülür.

34 Sabit sıcaklık ve belli bir çözücü kullanılsa bile bazen, absorptivitenin () sabit olmadığı ve Beer eğrisinden sapmalar olduğu görülebilir. Bu pozitif ve negatif sapmalara neden, ışığın monokromatik (tek dalga boyuna sahip) olmaması ve maddenin çözeltide polimerizasyona uğraması olabilir.

35 Spektrofotometrik ölçümlerde kör, standart ve numune olmak üzere üç tip çözelti hazırlanır.
1- Kör, cihazın optik ayarlarının (sıfır ve 100 ayarı) yapılması amacıyla kullanılan bir çözeltidir. Kör çözeltisi olarak destile su veya reaktifin kendisi de kullanılabilir. Bazı ölçümlerde numune körü de kullanılabilir. 2- Standart, aranan maddenin bilinen konsantrasyondaki çözeltisidir. 3- Numune, içindeki madde miktarını tayin etmek istediğimiz çözeltidir.

36 TÜREV SPEKTROSKOPİSİ UV-görünür bölge spektrumunda, üst üste binen ve çakışan bantların ayırım gücünün zayıf olması ve türev spektroskopisinin bu sorunlara belli oranda çözüm getirebilmesi nedeniyle türev spektroskopisi, morötesi-görünür bölge spektroskopisinde nitel ve nicel analizde kullanım alanı bulan bir yöntemdir. Bir örneğin absorbansının (A), dalga boyu ()'na karşı türevi alınarak elde edilir. Birinci, ikinci veya daha yüksek dereceden spektrumlar alınabilmesi esasına dayanır. Genel olarak, bütün türev spektrumları, esas (sıfırıncı dereceden) spektrumda gözlenemeyen özellikleri ortaya çıkarır. Absorbsiyon bandı olarak Gauss eğrisi örnek alındığında, birinci dereceden türev max değerini veya "gizli kalmış" pikleri bulmak için kullanılabilir, çünkü max için dA/d = 0 dır. İkinci dereceden türevler, esas banttan daha dar fakat onunla çakışan, 1 ekseninin üstünde veya altında merkezi bir pik verirler. Bundan dolayı ikinci dereceden türev spektroskopisi, morötesi-görünür bölge spektroskopisinde daha çok kullanılır.

37 İLAÇ ETKEN MADDELERİNİN UV-SPEKTROSKOPİSİ YARDIMI İLE MİKTAR TAYİNİ
Etken maddenin miktar tayini için yapılan işlemler genel olarak şöyle sıralanabilir: 1- Analizi yapılacak ilaç etken maddesi, önce kristallendirme gibi bir yolla saflaştırılmalıdır. Bunun için aranan standart hazırlama yöntemleri, farmakopelerde ya da literatürlerde bulunabilir. 2- UV ışığını absorplamayan, spektral saflıkta bir çözücü seçilir. 3- İlaç etken maddesi, seçilen çözeltide çözülür ve bu çözeltiden spektrofotometrenin 2. küvetine doldurulup yerine yerleştirilir. Maddenin max. enerjiyi absorbe ettiği dalga boyu saptanır. Tüm tayinler, bu dalga boyuna göre yapılır. İlaç etken maddesinin farklı konsantrasyonlardaki çözeltilerinin absorbans değerlerini ölçmek suretiyle absorptivite tayin edilir.

38 Absorbans ile konsantrasyon arasında Beer kanununa göre doğrusal bir ilişki olmalıdır. Genellikle miktar tayini doğrusal orantının var olduğu sınırlı bir alan içinde yapılabilir. Beer kanunundan sapmalar çözeltinin tabiatından ileri gelebildiği gibi, çözeltideki kimyasal değişmelerden de ileri gelebilmektedir. 4- Bir ilaç müstahzarındaki belirli bir aktif maddenin miktarı tayin edilirken, absorpsiyonu etkileyecek başka maddeler ya da kirlilikler de bulunabileceğinden, çözeltiyi hazırlamadan önce bu yan maddelerin ekstraksiyon, kromatografi, destilasyon gibi yöntemlerle aktif maddeden ayrılması ve ancak bundan sonra aktif maddenin uygun bir çözücüye alınarak absorpsiyonunun ölçülmesi gerekir. Cx: miktarı bilinmeyen maddenin kons., Cs: standart maddenin kons., Ax: miktarı bilinmeyen maddenin absorbansı, As: standart maddenin absorbansı.

39 KARIŞIMLARIN ANALİZİ Birden çok ilaç hammaddesi içeren bir karışımın, herhangi bir dalga boyundaki absorbansını ölçmek suretiyle karışımdaki maddelerin miktarını tayin etmeye olanak yoktur. Çünkü okunan absorbans değeri maddelerden herhangi birinin değil, karışımdaki tüm maddelerin ortak absorpsiyon değeridir. Bununla beraber, eğer ikili bir karışımdaki maddeler birbiri ile reaksiyon vermiyorsa ve maddelerin her biri ayrı ayrı Beer kanununa uyuyorsa, bunların absorbansını, kendilerine ait dalga boylarında ayrı ayrı ölçmek suretiyle miktar tayinleri yapılabilir. Öncelikle saf maddelerin spektral verileri bilinmelidir. Bileşenlerin absorptivite değerleri doğru olarak tayin edilmelidir. Karışımdaki maddeler x ve y gibi iki ayrı madde ise, bunların max. absorbanslarının ölçüldüğü dalga boyu değerleri bulunarak, iki bilinmeyenli bir denklem şeklinde çözümü uygulanır. Absorbans (A1)= aa  b. Cx + ab b. Cy Absorbans (A2)= ac  b. Cx + ad  b. Cy Absorptivite değerleri

40 ALLOPURİNOL TABLETLERİ’ne UV yönteminin uygulanması:
20 tablet tartılır, iyice toz edilir. Bu tozun 100 mg civarında allopurinole eşdeğer miktarı tam olarak tartılır. 100 ml’lik bir balon jojede 20 ml 0,1 N sodyum hidroksit ile 5 dk. çalkalanır, sonra su ile 100 ml’ye tamamlanır ve karıştırılır. Bir süzgeçten süzülerek, çözeltinin 10 ml’si 1000 ml’lik balon jojeye aktarılarak, 0,1 N HCl ile 1000 ml’ye tamamlanır ve karıştırılır. 50 mg civarında tam olarak tartılmış allopurinol referans standardı, 50 ml’lik bir balon jojede 10 ml 0,1 N sodyum hidroksitte hafifçe ısıtılarak çözülür, soğutulur ve su ile 50 ml’ye tamamlanır. 1 ml’sinde 10 µg madde içerecek şekilde standart bir çözelti elde etmek için 0,1 N HCl ile seyreltilir. Her iki çözeltininde max. absorbansları 0,1 N HCl körüne karşı, 250 nm civarında max. absorbansın olduğu dalga boyunda okunur. Tm = 10. C. (Am/As) formülü ile alınan tablet tozundaki allopurinol miktarı (Tm) mg olarak hesaplanır. C: standart çözeltideki allopurinol referans standardının ml’deki µg olarak konsantrasyonudur. Am: allopurinol tablet çözeltisinin, As: referans çözeltinin absorbanslarıdır.

41 KLORPROMAZİN HİDROKLORÜR enjeksiyon çözeltisine UV yönteminin uygulanması:
100 mg civarında klorpromazin hidroklorüre karşı gelen enjeksiyon çözeltisinin tam ölçülmüş hacmi alınarak, 0,1 N HCl ile 500 ml’ye seyreltilir ve karıştırılır. Çözeltinin 10 ml’si bir ayırma hunisine alınır ve 20 ml su ilave edilerek, amonyum hidroksit ile bazik yapılır. 4 kez 25 ml eterle ekstrakte edilir. Birleştirilen eterli ekstreler 4 kez 25 ml 0,1 N HCl ile tekrar ekstrakte edilir. Sulu ekstreler 250 ml’lik bir balon jojede toplanır. Havada bırakılarak eterin uçurulması sağlanır. 0,1 N HCl ile 250 ml’ye tamamlanır ve karıştırılır. Klorpromazin hidroklorürün referans standardının tam tartılmış miktarı, 0,1 N HCl’de çözülür. 1 ml’de 8 µg madde içeren standart çözelti verecek şekilde 0,1 N HCl ile seyreltilir. Her iki çözeltinin absorbansları, 1 cm’lik küvetlerde 254 ve 277 nm civarında, 0,1 N HCl körüne karşı tayin edilir. Alınan enjeksiyon çözeltisinin her 1 ml’sindeki klorpromazin hidroklorür miktarı, mg olarak; Tm = 12,5. C. (A254 - A277)m / V. (A254 - A277)s formülü yardımıyla hesaplanır.