Klonlamada Plazmit Seçimi

... konulu sunumlar: "Klonlamada Plazmit Seçimi"— Sunum transkripti:

1 Klonlamada Plazmit Seçimi
Prof. Dr. Salih Kuk Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı

2 Klonlamada Plazmit Seçimi
Gen Klonlama nedir? Amaç Gen klonlamada temel elemanlar (Gen ve Vektör) Vektör çeşitleri (Plazmitler..) Plazmit nedir? Tarihçesi Plazmitlerin özellikleri Plazmit seçimi (tercihi)

3 Gen klonlama nedir? Yapı, Fonksiyon, Aşı gibi amaçlarla
Bir genin birçok kopyasını oluşturması Yapı, fonksiyon ve aşı gibi amaçlar için araştırılan bir genin birçok kopyasını oluşturması işlemine kısaca gen klonlaması adı verilmektedir.

4 Gen klonlamada amaç nedir?
Gen izolasyonu, Gen bankalarının oluşturulması, Genlerin yapı ve fonksiyonlarının araştırılması Klonlanan genlerin üzerinde fonksiyonel bölgelerin belirlenmesi, DNA dizi analizlerinin kolaylaştırılması, DNA aşılarının oluşturulması, Rekombinant proteinlerin açıklatılması Gen izolasyonu, gen bankalarının oluşturulması, genlerin güvenlik altına alınarak onların yapı ve fonksiyonları üzerinde araştırmalar yapılması, klonlanan genlerin üzerinde mutasyonlar yapılarak fonksiyonel bölgelerin belirlenmesi, DNA dizi analizlerinin kolaylaştırılması, DNA aşılarının oluşturulması ve rekombinant proteinlerin açıklatılması gibi amaçlarla yapılan gen klonlama çalışmaları biyoteknolojik çalışmalarının önemli bir basamağını oluşturmaktadır.

5 Gen klonlamanın temel ilkesi
Bir genin vektöre yerleştirilmesi Bu vektörün bakteri hücrelerine transformasyonu Hücrelerin bölünmesi ve vektörün de içerdiği genin birçok kopyasını oluşturmaktadır

6 Klonlamanın temel elemanları
Gen Gen seçimi Vektör Vektör seçimi Bu bağlamda klonlama işleminde iki önemli yapı bulunmaktadır: ilgili gen ve vektör.

7 Klonlamada kullanılan Vektörler
Virus Bakteriler, Bakteriofajlar, Plazmitler, Kozmid ve mayalar vektör Klonlama çalışmalarında vektör olarak: virus ve bakteriler, bakteriofajlar, plazmitler, nadiren de kozmid ve mayalar vektör olarak kullanılmaktadır.

8 Viral vektörler Genlerin hücrelere aktarılması ve gen ekspresyon çalışmaları için virusların modifikasyonu ile oluşturulmuşlardır. Herpes, Adeno, Retro, Vaccinia, Polyoma, Baculovirus gibi birçok virus Viral vektörler, genlerin hücrelere aktarılması ve gen ekspresyon çalışmaları için virusların modifikasyonu ile oluşturulmuşlardır. Bu amaçla herpes, adeno, retro, vaccinia, polyoma, baculovirus gibi birçok DNA ve RNA virusu vektör olarak kullanılmıştır.

9 Bakteriyel Vektörler S. typhimurium, E. coli,
Bacille Calmette Guerin (BCG) suşu gibi bakteriler Bununla birlikte S. typhimurium, E. coli, Bacille Calmette Guerin (BCG) suşu gibi bakteriler de klonlamada denenmektedir.

10 Bakteriofajlar Virus olarak bilinen, Bakterileri infekte eden,
Çoğunlukla DNA nadiren de RNA içeren, Proteinden yapılı, Kapsit ile çevrilmiş basit yapılardır Bakteriofajlar; virus olarak bilinen, bakterileri infekte eden, çoğunlukla DNA nadiren de RNA içeren ve proteinden yapılı kapsit ile çevrilmiş basit yapılardır.

11 Kozmitler Cos dizisi ile mid dizisisinin laboratuvar ortamında birleştirilmesiyle oluşturulurlar 45 kb.’lik DNA’ların klonlanmasına olanak veren vektörlerdir. Kozmitler; cos dizisi ile mid dizisisinin laboratuvar ortamında birleştirilmesiyle oluşturulurken ve 45 kb.’lik DNA’ların klonlanmasına olanak veren vektörlerdir.

12 Plazmitler ve Özellikleri
Plazmid terimi Amerikalı moleküler biyolog Joshua Lederberg tarafından 1952'de ilk defa kullanılmıştır Gen klonlama çalışmalarında daha yoğun kullanılan yapılardır Bakteri ve diğer organizmalarda bulunurlar, Gen klonlama çalışmalarında daha yoğun olarak kullanılan yapılardır plazmitlerin büyüklüğü 1 kb’den 200 kb’ye kadar değişebilmektedir. Plazmitler, bakteri ve diğer organizmalarda bulunan, konak hücre kromozomundan bağımsız olarak çoğalan küçük, yuvarlak yapılı kromozom dışı çift zincirli DNA’lardı

13 Plazmitler ve Özellikleri
Konak hücre kromozomundan bağımsız olarak çoğalırlar, Küçük ve yuvarlak yapılı, Büyüklüğü 1 kb kb, Kromozom dışı çift zincirli DNA’lardır. Gen klonlama çalışmalarında daha yoğun olarak kullanılan yapılardır plazmitlerin büyüklüğü 1 kb’den 200 kb’ye kadar değişebilmektedir. Plazmitler, bakteri ve diğer organizmalarda bulunan, konak hücre kromozomundan bağımsız olarak çoğalan küçük, yuvarlak yapılı kromozom dışı çift zincirli DNA’lardı

14 pBR322 plazmiti pBR322 -1977’de Herbert Boyer, California Ünv. lab
p, plazmit BR, Post-doc "Bolivar" ve "Rodriguez” Biyoteknolojik çalışmalarda ilk kullanılan plazmit pBR322’dir. pBR322, ampisilin ve tetrasiklin direnç genleri ve birçok restriksiyon enzim bölgesi içermektedirler.

15 pBR322 plazmiti Ampisilin ve tetrasiklin direnç genleri
Birçok restriksiyon enzim bölgesi Biyoteknolojik çalışmalarda ilk kullanılan plazmit pBR322’dir. pBR322, ampisilin ve tetrasiklin direnç genleri ve birçok restriksiyon enzim bölgesi içermektedirler.

16 pUC plazmiti pBR322’nin yarısı büyüklüğünde (daha büyük DNA’ların klonlar) pBR322’den geliştirildi Sonraları pBR322’nin yarısı büyüklüğünde olan daha büyük DNA’ların klonlanmasına izin veren ve pBR322’den geliştirilen pUC plazmitleri kullanılmaya başlamıştır. pUC plazmitleri birçok farklı restriksiyon enzimiyle kesilebilen polilinker bölge (multiple cloning site) içermektedirler. E.coli’nin lac Z geni içerisinde yer alan polilinker bölgeye sokulan DNA, lac Z geninin bozulmasına sebep olarak beyaz bakteri kolonilerinin oluşmasını ve dolayısıyla rekombinant DNA’yı taşıyan hücrelerin kolaylıkla tanınmasını sağlamaktadır.

17 pUC19 ve pUC18 Messing ve ark. p, plazmit UC, University of California
pUC18, pUC19’a benzer, MCS ters

18 pUC18/19

19 Hangi plazmiti kullanmalı!
Plazmitlerin Özellikleri Kullanım Amacı

20 Gen Klonlamada Plazmit Seçimi
Plazmit özellikleri Büyüklük, Kopyalama sayısı, Seçim marker, Klonlama bölgesi Üretici firmaların plazmit dizaynı Despite the bewildering choice of commercial and other available vectors, the choice of which cloning vector to use can be decided by applying a small number of criteria: insert size, copy number, incompatibility, selectable marker, clon­ing sites, and specialized vector functions.

21 Plazmitlerin Özellikleri (multiple cloning site)(MCS)
Birçok farklı restriksiyon enzimiyle kesilebilen polilinker bölge (multiple cloning site) içermektedirler. Sonraları pBR322’nin yarısı büyüklüğünde olan daha büyük DNA’ların klonlanmasına izin veren ve pBR322’den geliştirilen pUC plazmitleri kullanılmaya başlamıştır. pUC plazmitleri birçok farklı restriksiyon enzimiyle kesilebilen polilinker bölge (multiple cloning site) içermektedirler. E.coli’nin lac Z geni içerisinde yer alan polilinker bölgeye sokulan DNA, lac Z geninin bozulmasına sebep olarak beyaz bakteri kolonilerinin oluşmasını ve dolayısıyla rekombinant DNA’yı taşıyan hücrelerin kolaylıkla tanınmasını sağlamaktadır.

22 Plazmitlerin Özellikleri (Replikasyon orjini)
Plazmitlerin, bakterilerde replikasyonunu sağlayan ve birkaç yüz baz çifti uzunluğunda replikasyon orjinleri bulunmaktadır. Bu şekilde amaca göre düşük veya yüksek sayıda replike olabilen plazmitler oluşturulmuştur.

23 Plazmitlerin Özellikleri (Promotor bölgeler)
Bakteriofajlardan elde edilen T3, T7, SP6 ve tac promotorları içerir Gen ekspresyon çalışmalarında kullanılacak plazmitlerin birçoğu ise, Sitomegalo virüs (SMV) promotoru ve Simian virus promotoru (SV40) içermektedir.

24 Plazmitlerin Özellikleri………… (Direnç genleri)
Plazmitler ampicillin, neomicin, kanamicin gibi bir çok direnç geni içerirler

25 Plazmitlerin Özellikleri (Mavi-beyaz seçim)
lac Z geni içerisinde yer alan polilinker bölgeye sokulan DNA, lac Z geninin bozulmasına sebep olarak beyaz bakteri kolonilerinin oluşmasını ve dolayısıyla rekombinant DNA’yı taşıyan hücrelerin kolaylıkla tanınmasını sağlamaktadır. Sonraları pBR322’nin yarısı büyüklüğünde olan daha büyük DNA’ların klonlanmasına izin veren ve pBR322’den geliştirilen pUC plazmitleri kullanılmaya başlamıştır. pUC plazmitleri birçok farklı restriksiyon enzimiyle kesilebilen polilinker bölge (multiple cloning site) içermektedirler. E.coli’nin lac Z geni içerisinde yer alan polilinker bölgeye sokulan DNA, lac Z geninin bozulmasına sebep olarak beyaz bakteri kolonilerinin oluşmasını ve dolayısıyla rekombinant DNA’yı taşıyan hücrelerin kolaylıkla tanınmasını sağlamaktadır.

26 Gen Klonlamada Plazmit Seçimi
1977’lerden günümüze 40 yıla yakın Çok sayıda firma/vektör Since the construction of the first generation of general cloning vectors in the early 1970s, the number of plasmids created has increased to an almost countless number. Thus, a critical decision facing today's investigator is that of which plasmid to use in a particular project?

27 Geleneksel Gen Klonlama
pUC ve pBR gibi plazmitler Plazmit ve çoğaltılan genlerin bir veya birden çok kesim enzimleriyle kesilmesi Agaroz jelden saflaştırması ve Genin plazmite ligasyonu Klonlama çalışmalarında geleneksel olarak pUC ve pBR gibi plazmitler kullanılmıştır. Bu tür plazmitlerin kullanımı sırasında, plazmit ve çoğaltılan genlerin bir veya birden çok kesim enzimleriyle kesilmesi ve agaroz jelden saflaştırması ve sonradında ilgili genin plazmite ligasyonu gibi işlemler gerekmektedir

28 Modern Gen Klonlama AMAÇ 1; Genin çoğaltılması ve
Korunma altına alınması pJET1.2 ve TOPOXL Direkt PCR ürünleri Plazmit 5dk Çalışmalarda amaç genin çoğaltılması ve korunma altına alınması ise bizimde kullandığımız pJET1.2 ve TOPOXL gibi bir plazmiti seçebilir. pJET künt uçlu DNA’ların ligasyonuna izin vermektedir. TOPOXL plazmiti, yapısındaki topoizomeraz aktivitesi ile ligaz ilişkili vektör sistemlerine göre önemli avantajlar sağlamaktadır. Her iki sistemde de sistemde sadece vektör ve PZR ile çoğaltılan gene gereksinim duyulmakta ve vektöre genin yerleştirilmesi işlemi beş dakikada tamamlanmaktadır.

29 pJET1.2 ve TOPOXL

30 Modern Gen Klonlama AMAÇ 1; (Genin çoğaltılması ve Korunma altına alınması) pGEM-T, pTARGET Direkt PCR ürünü Ligasyon 1-16 saat(Bir gece) Bu plazmitler dışında, PinPoint Xa-T, pGEM-T ve pTARGET gibi plazmitler de PCR ile çoğaltılan genin enzim kesimlerine ihtiyaç duyulmaksızın plazmite direkt olarak yerleştirilmektedir. Fakat ligasyon işlem için bir saat veya çoğunlukla bir gecelik bir inkübasyon süresi gerekmektedir

31 pGEM-T ve pTARGET

32 Modern Gen Klonlama AMAÇ 2; Protein expresyonu pCI-neo pTARGET
Enzim kesimleriyle genin yerleştirilmesi pTARGET Direkt PCR ürününün yerleştirileceği Protein ekspresyon çalışmalarında protein expresyonu için dizayn edilmiş plazmitler kullanılmaktadır. Bu amaçla geleneksel olarak enzim kesimleriyle genin yerleştirileceği pCI-neo gibi plazmitler kullanılabileceği gibi direkt PCR ürününün yerleştirileceği pTARGET gibi plazmitler de kullanılabilmektedir.

33 pCI-neo

34 Modern Gen Klonlama AMAÇ 3; Protein expresyonu ve pürifikasyonu
pcDNA3.1/V5-His-TOPO® plazmiti V5 epitop kuyruğu ve C-terminal 6x His dizisi pET100 plazmiti C-terminal 6x His dizisi PinPoint Xa plazmitler biotin proteinini kodlayan dizi içeren protein ekspresyonunun tespitinde ve pürifikasyon çalışmalarında Protein ekspresyon ve pürifikasyon çalışmalarında çalışmalarında protein expresyonu ve pürifikasyonu için dizayn edilmiş plazmitler kullanılmaktadır. Bunlar dışında yapısında V5 epitop kuyruğu ve C-terminal 6x His dizisi bulunan pcDNA3.1/V5-His-TOPO® plazmiti, pET100 plazmiti ve biotin proteinini kodlayan dizi içeren PinPoint Xa gibi plazmitler protein ekspresyonunun tespitinde ve pürifikasyon çalışmalarında kullanıcılara önemli avantajlar sağlamaktadır (28).

35

36

37

38 Modern Gen Klonlama AMAÇ 4; Protein ekspresyon seviyesinin kantitatif ölçümü -Galaktosidaz reporter vektör, Kloramfenikol asetil transferaz reporter vektör, lusiferaz reporter plazmitlerden Protein ekspresyon seviyesinin kantitatif olarak ölçümünün gerektiği durumlarda ise -Galaktosidaz reporter vektör, Kloramfenikol asetil transferaz reporter vektör ve lusiferaz reporter plazmitlerden birinin seçilmesi genin o plazmite yerleştirilmesi gerekmektedir.

39

40 Modern Gen Klonlama AMAÇ 5; Hücre içi protein trafiği Plazmit
green fluorescent protein (GFP)’ i kodlayan gen dizisini içeren Bazı durumlarda ilgilenilen proteinin hücre içi trafiğinin incelenmesi gerekli olmaktadır ki bu durumlarda yapısında green fluorescent protein (GFP)’ i kodlayan gen dizisini içeren plazmitler kullanılmaktadır.

41

42 Modern Gen Klonlama Klonlama kitleri Avantajlar:
Çoğu zaman ilave malzeme gerekmez Pipet ve ucu Kontrol örnekler Optimize edilmiş protokol Klonlama çalışmaları sırasında plazmitlerin ilaveten klonlama kitleri de birçok firma tarafından sağlanmaktadır. Dolayısıyla bu kitlerin temini ile birçok malzemeyi ayrıca satın alarak kullanmak yerine optimize edilmiş protokol ile birlikte çalışma olanağı elde edilmektedir.

43 Modern Gen Klonlama Klonlama kitleri Dezavantajlar: Maliyet
Belirli reaksiyonluk 20, 40 reaksiyon Tabiî ki bu tür kitlerin daha maliyetli olduğu göz önünde tutularak karar verilmesi gerekmektedir.

44 Modern Gen Klonlama

45 Modern Gen Klonlama Firma web sayfaları (Vector Selection Tool)

46 Plazmit seçimi (tercihi)
Plazmitlerin özellikleri, Maliyet, Zaman, Laboratuar olanakları Bilgi ve beceri Ticari firmaların sundukları avantajlar Klonlama çalışmaları biyoteknolojik gelişmelerle birlikte araştırmaların hatta rutin çalışmaların içine yoğun olarak girmektedir. Dolayısıyla bu çalışmalar için seçilen plazmitlerin özelliklerinin yanı sıra maliyet, zaman ve çalışılan laboratuar olanaklarının ticari firmaların sundukları avantajlarla birlikte düşünülmesi en uygun plazmitin seçilmesinde önem taşımaktadır.

47 Twitter: @eruparazitoloji
TEŞEKKÜRLER http//parazitoloji.erciyes.edu.tr