Sunuyu indir
Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz
YayınlayanRidvan Dalman Değiştirilmiş 9 yıl önce
1
Ilıman İklim Meyve Türlerinde Çeşit ve Tiplerinin Moleküler Tekniklerle Karakterizasyonu Arzu SEZER Fındık Araştırma Enstitüsü Giresun
2
Corvallis, OREGON ABD 28 Aralık 2007-28 Şubat 2008
3
Department of Horticulture
Prof.Dr. Shawn MEHLENBACHER (Fındık Islah ve Genetiktisi)
4
National Clonal Germplasm Repository
Dr. Nahla BASSIL (Moleküler Genetikçi))
5
OSU Fındık Islah Programı
Amaç: “Eastern filbert blight”’a dayanıklı çeşitler İç fındık market taleplerine uygun çeşitler Kozalak akarına dayanıklılık Orta büyüklük, yuvarlak şekil Yüksek iç yüzdesi Erken verime yatma ve yüksek verim Kolay beyazlama özelliği Az kusur (boş, küflü, ikiz vs.) Erken olgunlaşma Kendiliğinden dökülen meyve EFB’a dayanıklı süs bitkisi olarak çeşitler
6
OSU Fındık Islah Programı
Her yıl: 40 melezleme 100’er fidan (toplam 4000 adet/yıl) 7.yılda 20 adet ağaç 8.yılda en iyi seleksiyonlarla proses yeniden başlıyor.
7
OSU Fındık Islah Programı:
6 yeni çeşit 8 tozlayıcı 2 süs bitkisi
8
The National Clonal Germplasm Repository
Gen bankası Ilıman İklim Meyveleri Sert kabuklu Meyveler Diğer Ürünler
9
National Clonal Germplasm Repository
İn vivo koleksiyon: 670 fındık ağacı 37 farklı ülkeden 355 çeşit 19 Corylus türü İn vitroda orta vadede saklama Cryopreservation ile uzun süreli saklama
10
Moleküler Yöntemler Mikrosatellit DNA (SSR) markırları
ABD fındık koleksiyonundaki bazı örneklerin parmakizi analizi AFLP yöntemi Bazı böğürtlen çeşitlerinin karşılaştırılması
11
Moleküler Yöntemler (Moleküler Markırlar)
Genetik Kaynak Yönetiminde Çeşitlerin tanımlanması Farklılıkların değerlendirilmesi Duplikasyonların giderilmesi Islah Programlarında MAS - Marker-assisted selection (Markır Destekli Seleksiyon) Haritalama
12
Yöntem Seçimi A. DNA dizisi biliniyorsa
SSRs (Simple Sequence Repeat Markers) Microsatellite Markers = Basit Dizi Tekrarları B. DNA dizisi hakkında bilgi yoksa RAPD (Random Amplified Polymorphic Markers) = Rastgele oligonükleotid primerleri ile çoğaltılmış polimorfik DNA AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) =Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi
13
Moleküler Analiz Basamakları
(1) Örneklerin toplanması 125 130 132 140 (2) DNA Ekstraksiyonu (3) PCR (4) Electrophoresis agarose gel elecrophoresis-capillary elecrophoresis (5) Marker Analizi
14
(1) Örneklerin toplanması
15
(2) DNA Ekstraksiyonu 1-Genç dokulardan
2-Puregene kit (Gentra Systems) protokol (2 x 96 örnek) 3-DNA konsantrasyonunun ölçümü ( VICTOR V multilabel plate reader (Perkin Elmer) 4-İstenen konsantrasyonun ayarlanması
16
Doku ezici Mixer Mill 301
18
3- PCR
19
DNA PCR için hedef bölge kromozom çekirdek Çift sarmal DNA molekülü
nükleotidler PCR için hedef bölge
20
İplikciklerin ayrılması (denaturasyon)
PCR ile DNA Çoğaltımı İplikciklerin ayrılması (denaturasyon) 5’ 3’ Kalıp DNA 5’ 3’ Primerlerin ilavesi (annealing)) 5’ 3’ Forward primer Reverse primer 5’ 3’ Kopyaların oluşması (extend primers) 32 döngüde 1.07 milyon kopya
21
PCR komponentleri • Steril deionize su • 10X PCR buffer • dNTP mix
• Primer • Taq DNA polymerase • MgCl2 • DNA
22
(4) Electrophoresis •Agarose gel electrophoresis (Ethidium Bromidele boyama ve UV görüntüleme) • Acrylamide gels (gümüş nitrat veya radyoizotop kullanarak) • Otomatik sequencer’da capillary electrophoresis (floresan etiketli primerler kullanarak)
24
(5) Marker Analizi
25
CEQ™ 8000 Genetic Analysis System
26
Fluorescently labeled run on capillary DNA “Sequencer”
27
Fragment Analizi
28
Simple Sequence Repeats (SSRs) Mikrosatellitler?
1-6 bp nucleotid tekrarları . (GAAG)12
29
SSRs-Mikrosatellitler
240 bp AT10AT14 240 bp 248 bp AT14 248 bp
30
Primer3 kullanarak primer dizaynı
SSR Marker Geliştirme Mikrosatellit kaynaklarının tespiti (kütüphaneler, GenBank) Microsatellit Belirleme (SSRIT, BLAST, …) Primer3 kullanarak primer dizaynı Gradient PCR (Ta) Polymorpfizmin taranması (agarose) Fragment analizi (floresan forward primerler kullanarak)
31
A B İki SSR lokusuna göre iki çeşit arasındaki farklılığın fragment analizinde gözlenmesi
32
Genetik Parmakizi Çeşit SSR Lokusu Name CA112 CA169 CA190 Atlantic
142/148 109/112/115/127 240/243/246 Aurora 142/144/146 109/112/121 240/243 Bluecrop 142 109/115 240 Bluejay 142/144/146/148 115/121 Blueray 142/144/148 109/112/115 Bluetta 112/115/118/121 240/246 Cabot 142/144/149 112/115/121/127 Chandler 142/144 109/115/121/127 Coville 109/112/115/121 Draper Duke 112/115
34
SSRs Avantajları: Dezavantajları:
Ko-dominant ve locus-specific markırlar Yüksek oranda polimorfik Genomda bol sayıda ve rastgele dağılmışlardır Laboratuarlar arasında paylaşımı kolaydır Yüksek genotiping özelliği Dezavantajları: İlk Markır geliştirme pahalı ve çok zaman alıcıdır Taxa-spesifik
35
SSRs Uygulama Çalışması
36
USDA National Clonal Germplasm Repository
İn vivo koleksiyon: 670 fındık ağacı 37 farklı ülkeden 355 çeşit 19 Corylus türü İn vitroda orta vadede saklama Cryopreservation ile uzun süreli saklama
37
Yedek Corylus Koleksiyonu (Parlier, CALIFORNIA)
’de Parlier, California’da yedek Corylus koleksiyonu Koleksiyonu Eastern Filbert Blight (EFB)’a karşı korumak amacıyla 184 örnek
38
29 yedek koleksiyon ağacı atipik veya karışık morfolojide
Problemler! Corvallis Ana Koleksiyon: Kendinden köklü ağaçlar Parlier Yedek Koleksiyon: Aşılı ağaçlar 29 yedek koleksiyon ağacı atipik veya karışık morfolojide
39
Amaç İki koleksiyondaki DNA’ların SSR’lar ile karşılaştırılması
12 SSR’lık parmakizi analiz setinin test edilmesi 29 örneğin tanımlanmasını güncellemek
40
Fingerprinting Set Primer Multiplex Tag Ta (°C) Size Range CAC-B028 1
D4 55 CAC-A040 D3 62 CAC-B619 CAT-B501 D2 64 CAC-B617 2 59 CAC-B753 CAC-C040 CAC-B776 65 CAC-B657 3 CAC-C028 60 CAC-B606 CAC-B719
41
Genetik Parmakizi ID Primer-B028 Primer-B501 77.001C 258/274 120/134
260/272 134/138 8.001P1 8.001P2 266/272 126/128
42
Cluster Analysis, PowerMarker
0.1 Closca Molla P Closca Molla C TGDL P TGDL C Artellet P2 Artellet P1 Artellet C Louisen Zell P Louisen Zell C Pallagrossa P Pallagrossa C Kunzemuller Zell P Kunzemuller Zell C Tonda Bianca C Kruse P Kruse C Butler P Butler C Royal P Royal C Freehusker P Freehusker C Cosford P Cosford C Istrska Okrogloplodna P Istrska Okrogloplodna C Tonda di Giffoni P Tonda di Giffoni C Tombul Ghiaghli P Garibaldi P Garibaldi C C.hyb. NY104 P C.hyb. NY104 C Gasaway P Gasaway C Dundee P Dundee C Morrisoka P Morrisoka C Laroka P Laroka C C.hyb. Chinese Trazel J1 P C.hyb. Chinese Trazel J1 C Tonda Bianca P Negret P1 Negret C Grifoll P Grifoll C SantJ aume P Sant Jaume C Negret P2 Tonda Romana P Tonda Romana C Tombul Ghiaghli C Bulgaria XI8 P Bulgaria XI8C Yanlış etiketlenmiş ağaçlar: ‘Tonda Bianca’ ‘Tombul Ghiaghli’ ‘Negret’
43
SSR Fingerprinting Panel Verifies Tree Identities in Backup USDA Hazelnut Genebank
Nahla Bassil1, J. Postman1, K. Hummer1, M. Botu2 and A. Sezer3 1USDA-ARS, NCGR, Corvallis, OR 2Fruit Growing Research & Extension Station, Valcea, ROMANIA 3Hazelnut Research Institute, Giresun, TURKEY
44
UV transilluminator ile görüntüleme
RAPD (Random Amplified Polymorphic Markers) DNA İzolasyonu 10 bp’lık primerlerle PCR Agarose gelde ayrım UV transilluminator ile görüntüleme
45
RAPD Marker Avantajları Dezavantajları Basit PCR Düşük Maliyet
Universal primerler Dezavantajları Düşük tekrarlanabilirlik
46
AFLP Prosedür: - Restriksiyon-Digestion - Adaptor Ligation
- Amplification - Electrophoresis
47
Restriksiyon-Digestion
Adaptor Ligation Amplification Electrophoresis
48
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) =Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi
51
AFLPs Örnek EFB R ile ilişkili olabilecek bir markır A8 B1
R S R R R S S S R R R S R R R S S S AFLPs Örnek EFB R ile ilişkili olabilecek bir markır Source: Joel Davis Source: Joel Davis
52
AFLPs Avantajları Dezavantajları Yüksek tekrarlanabilirlik
Yüksek multiplekslik oranı Yüksek genotyping gücü Dezavantajları Yüksek kalitede DNA gerektirir Dominant marker
53
AFLPs Uygulama Çalışması
NCGR’de mikroçoğaltım ile çoğaltılan bazı böğürtlen çeşitlerinde somoclonal varyasyon?
54
2 farklı ana bitki Toplam 15 örnek Varyasyon yok
57
TEŞEKKÜRLER
Benzer bir sunumlar
© 2024 SlidePlayer.biz.tr Inc.
All rights reserved.