GENETİK TANI YÖNTEMLERİ Doç.Dr. Zerrin Yılmaz Çelik

... konulu sunumlar: "GENETİK TANI YÖNTEMLERİ Doç.Dr. Zerrin Yılmaz Çelik"— Sunum transkripti:

1 GENETİK TANI YÖNTEMLERİ Doç.Dr. Zerrin Yılmaz Çelik
Tıbbi Genetik AbD

2 Amaç; Bir hastalığın genetik bozukluğa bağlı olup olmadığını belirlemek. Olası genetik bozukluğu göstererek hastalığın tanısını koymak. Bir sonraki kuşakta tekrarlama riskini belirlemek ve tekrarlamaması için önlem almak.

3 ÖNCEKİ BİLDİKLERİNİZ:
GENETİK YAPI NEDİR? NORMAL - NORMAL VARYANT ANORMAL GENETİK BOZUKLUKLARIN YERİ VE SONUÇLARI (KİŞİSEL, AİLESEL ve TEKRARLAMA RİSKLERİ?) ÖĞRENECEKLERİNİZ: TANIDA HANGİ YÖNTEMLER KULLANILIR? YÖNTEM SEÇİMİ HANGİ YÖNTEM NE ZAMAN KULLANILIR ?

4 Genetik bilgi hücrede farklı zamanlarda farklı şekillerde
bulunur.

5 GENETİK HASTALIKLARI HATIRLAYALIM
KROMOZOM BOZUKLUKLARI TEK GEN BOZUKLUKLARI POLİGENİK BOZUKLUKLAR MİTOKONDRİYEL DNA BOZUKLUKLARI SOMATİK HÜCRENİN GENETİK HASTALIĞI- KANSER

6 HASTAYA (DANIŞANA) YAKLAŞIM

7 AİLE HİKAYESİ VE PEDİGRİ ANALİZİ YÖNTEM SEÇİMİ
1. GENETİK DANIŞMA AİLE HİKAYESİ VE PEDİGRİ ANALİZİ YÖNTEM SEÇİMİ Hastanın yazılı onayının alınması!! 2. TANI KLASİK VE MOLEKÜLER SİTOGENETİK YÖNTEMLER MOLEKÜLER GENETİK YÖNTEMLER 3. GENETİK DANIŞMA SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ VE ÖNERİLER

8 Pedigri; bir ailenin bütün kuşaklarının gösterildiği şematik
bir analiz yöntemidir. *genetik özelliklerin hastalık oluşumuna etkisi *kalıtım tipinin belirlenmesi *aktarılma olasılığının değerlendirilmesi

9 Otozomal dominant kalıtım
Otozomal resesif kalıtım

10 SİTOGENETİK Kromozomların çeşitli boyama yöntemleri ile boyanarak morfolojik yapısı ve sayısı bakımından incelenmesidir.

11 SİTOGENETİK ÇALIŞMA ENDİKASYONLARI
A. Postnatal endikasyonlar B. Prenatal endikasyonlar

12 POSTNATAL TANI ENDİKASYONLARI 1
Erken dönemde büyüme ve gelişme bozuklukları Gelişme geriliği, boy kısalığı Dismorfik yüz görünümü Çok sayıda malformasyon Belirsiz (Ambigius) genitalya Mental motor retardasyon Tek neden veya birden fazla neden bir arada olabilir. 2. Ölü doğum ve neonatal ölüm Nedeni belirlemek ve kromozom bozukluğunu dışlamak için yapılmalıdır.

13 POSTNATAL TANI ENDİKASYONLARI 2
3. Fertilite problemleri Amenore prematür menopoz İnfertilite Tekrarlayan gebelik kayıpları 4. Aile öyküsü Yakın akrabaların birinde bilinen kromozom bozukluğu veya şüphesi. 5. Neoplaziler Tanısal ve prognostik bilgi sağlar.

14 PRENATAL TANI ENDİKASYONLARI 1
1. İleri anne yaşı (en sık) 2. Önceki çocukta kromozom bozukluğu 3. Anne- babada kromozomal translokasyon ya da diğer yapısal ve sayısal bozukluklar 4. Etiyolojisi bilinmeyen mental retardasyon ve/ veya konjenital malformasyon öyküsü

15 PRENATAL TANI ENDİKASYONLARI 2
5. Reprodüktif öyküde 2 veya daha fazla spontan abortus ve ölü doğumlar 6. Ultrasonografik taramada anomali saptanması 7. Yüksek maternal tarama testi 8. Sosyal endikasyon

16 KROMOZOM ELDESI Çekirdekli ve bölünebilen hücreler gerekir.
Alınan materyal uygun koşullarda ve steril olarak laboratuvara gönderilmelidir. * periferik kan lenfositleri (HEPARİNLİ TÜP/ ENJEKTÖR) * kemik iliği * deri fibroblastları (cild biyopsisi) * solid tümör biyopsisi (TAŞIMA MEDYUMU * tahliye materyali İÇİNDE) * koryon villus biyopsisi * amniyosit hücreleri (STERİL ENJEKTÖRDE) * plevral sıvı (STERİL KAP İÇİNDE)

17 Hücreler uygun besi yerine (medyum) ekilerek kültür hazırlanır.
Fitohemaglutinin, amino asit ve antibiyotik içeren medyum içinde 72 saat 37°C de bekletilir. saatte kolşisin eklenir. Hipotonik (tuz çözeltisi – çoğunlukla KCL) Fiksatif çözeltisi (1 Asetik asit; 3 Metanol) Yayma (soğuk ve nemli lam üzerine) Boyama Analiz

18 KROMOZOM BOYAMA (bantlama) YÖNTEMLERİ
Rutin uygulananlar: Giemsa Bantlama Yöntemi Yüksek rezolusyon bantlama Floresan Bantlama Yöntemi Revers Bantlama Yöntemi Özel durumlar için kullanılanlar: Sentromerik heterokromatin Bantlama Yöntemi Nükleolar Oluşum Bölgesi (NOR) Bantlama Yöntemi Kardeş Kromatin Bantlama Yöntemi (SCE) DEP testi

19 Giemsa Tripsin bantlama yöntemi, GTG :
Sitogenetik laboratuvarlarında en sık kullanılan yöntemdir. Kromozomların elde edilen bant özellikleri hem fonksiyonel hem de yapısal kompozisyonu yansıtmaktadır. Koyu bantlar genel olarak DNA ları S evresinin geç dönemlerinde replike olan bölgeleri gösterir. Buralar A+T bazlarınca zengindir, içerdikleri aktif gen sayısı azdır. Sayısal analiz için en az 20 metafaz, yapısal analiz için en az 5 metafaz değerlendirildikten sonra rapor verilebilir.

20 450 bant gözlenir, Işık mikroskobu ile 5-10 Mb kadar olan dengesiz yapısal kromozom bozuklukları saptanabilir.

21 A 1-3 B 4-5 C X D E F G Y

22 Yüksek rezolusyon bantlama, HRB:
Prometafazda elde edilen kromozomlar incelenir. Bant sayısı arasındadır. 5 Mb lık değişimler saptanabilir.

23 Floresans bantlama yöntemi
Q bant Revers bantlama yöntemi R bant

24 Toplumda %30 oranında kromozom yapısında, tekrarlayan DNA miktarına bağlı ışık mikroskopu ile görülebilecek kadar belirgin farklılıklar bulunabilmektedir. Bu bölgeler aktif gen içermemektedir. Buna “heteromorfizm” denmektedir, normal varyant olarak raporda bildirilir. Y kromozomu uzun kol heterokromatin bölgesi Sentromerik heterokromatin (1, 9, 16) Satellit bölgeleri Frajil bölgeler

25 Sentromerik heterokromatin bantlama
(C-Band) N 1 16qh+ N16 1qh+

26

27 NOR bantlama Akrosentrik kromozomlardaki polimorfizmlerin gösterilmesinde kullanılır.

28 DEB testi 24 saatlik rutin lenfosit kültürü sonrasında DEB (diepoksibütan) eklenmesi 48 saat daha inkübasyon, 72 saat sonunda standart çıkarım ve Giemsa boyama sonrasında analiz yapılır. hücrede kırık sayılır. % hesaplanır, hastanın normal kültürü ve eş zamanlı yapılan pozitif ve negatif kontrollerle beraber değerlendirilir. Fankoni Anemisi

29 Kardeş kromatid bantlama(SCE)
Normal 6-10 E/hc Bloom Sendromu >50 E/hc Kardeş kromozomlar arasındaki parça değişiminin artması, toksik ajanlara maruz kalınması ile artar!

30 7 der7 10 der10 t(7;10)(p13;q11.2)

31 dup(1)(q22q32) Duplike 1 N1

32 45,XY,rob(13;14)

33

34

35

36 MOLEKÜLER SİTOGENETİK YÖNTEMLER
1. İN SİTU HİBRİDİZASYON (FISH) 2. FLOW SİTOMETRİ 3. KARŞILAŞTIRMALI GENOMİK HİBRİDİZASYON(CGH) 4. ARRAY CGH

37

38 Nükleik asid probları, komplementer DNA ve RNA ların
hibridizasyon yöntemi ile belirlenmesi için kullanılan İşaretli dizileridir. *Radyoizotopik işaretleme 125I, 32P, 35S, 3H işaretlenip X-ray otoradyografi ile saptanır *Nonizotopik işaretleme Biyotin veya digogsigeninle işaretlenip uygun antikorlarla saptanır. 2. Floresan işaretleme kırmızı, mavi, yeşil, sarı floresans veren florokrom maddeler kullanılarak floresan mikroskopta incelenir

39 FISH yönteminin uygulandığı örnekler;
* Fikse edilmiş kromozomlar * İnterfaz nukleusu üzerindeki çalışmalar * Uzatılmış tek zincirli DNA molekülleri * Nukleus ve alt ünitelerinin incelenmesi * Formalinle fikse edilmiş doku, kan ya da kemik iliği preparatları (parafin blok kesitleri)

40 Floresan Insitu hibridizasyon (FISH)
1. Kromozom preperatlarının hazırlanması. 2. Probların hazırlanması (işaretleme). 3. İn situ hibridizasyon A. Prob denaturasyonu ve hibridizasyon karışımı. B. Kromozom denaturasyonu. C. Hibridizasyon. 4. Mikroskobik inceleme.

41

42 Floresan işaretli Prob Çeşitleri:
1. Sentromer probları( satellit DNA tekrar dizisi) 2. Tüm kromozoma ait prob 3. LSI (lokus spesifik) prob 4. Telomerik Problar

43 CEPX yeşil CEPY turuncu Sentromer probları(tekrarlayan DNA dizi probları) - Kromozomu tanımak - Interfaz nukleuslarında kromozom anöploidilerini göstermek

44 TRİZOMİ 13 TRİZOMİ 18

45 ish22qdel lokusa spesifik prob (LSI) Anöploidi tanısı LSI 21 (21q22.13-q22.2) (Down Sendromu) Mikrodelesyon tanısı (del 22q11.2, Di George Sendromu)

46 Tüm kromozoma ait prob (WCP)
-Translokasyonların gösterilmesi -Marker kromozomların tanımlanması

47 47,XY,+ mar 47,XY,+idic(15)(q10q10)

48 FISH Kullanım Alanları :
Klinik sitogenetik İnterfaz nukleusunda kromozomal anomaliler Yapısal kromozomal anomaliler Kromozomal anöploidi taramaları Preimplantasyon genetik tanı/ tarama Prenatal tanı Kanser sitogenetiği Mikrodelesyon sendromları Gen Haritalanması *hedef genin kromozomal lokalizasyonunun belirlenmesi *Gen expresyon incelenmesi

49 Prenatal Tanı -Direkt amniyositlerin interfaz nükleuslarının incelenmesi -Amniyosentez veya CVS materyallerinin doku kültürü sonrası incelenmesi Preimplantasyon Tanı Embriyo biyopsi materyalinin (Blastomer) incelenmesi. Kanser sitogenetiği Örn 9. Kromozomun abl geni ile 22. Kromozomun bcr geni bcr/abl dual color prob ile analiz (Ph kromozomu)

50 Sitogenetikte avantajları
Kromozom eldesi olmasa da nukleus incelenerek kromozomlar hakkında bilgi edinilebilir. Analiz için eski preparatlar, aylar yıllar sonra kullanılabilir. Kısa sürede sonuç verilir, uzun dönem kültür gerektirmez. Mozaikliğin belirlenmesinde kolaylık sağlar. Marker kromozomların kaynağı belirlenebilir. Kromozomal mikrodelesyon sendromları belirlenebilir.

51 dezavantajları Sadece incelenen kromozom hakkında bilgi sağlar.
Hibridizasyon başarısı düşükse değerlendirmek zor. Yanlış pozitiflik oranı %10-15 Prob sayısı kısıtlı, aynı anda 5-6 kromozom sayısal olarak incelenebilir.

52 Geliştirilmiş FISH tenikleri
1. Multicolor (M-FISH) 2. Spectral karyotipleme (SKY FISH) 3. Fiber FISH 4. Primed İn Situ hibridizasyon (PRİNS)

53 Vaka sunumu 10 yıllık evli çift kaybettikleri iki çocukta multiple konjenital anomali nedeniyle yeni gebelik için risklerini öğrenmek için danışıyor, Kadın 29, erkek 30 yaşında, akraba değiller Ailede benzer durum yok, pediri analizinde kalıtım kalıbına uyan veya ailesel geçiş gösterilen bir durum yok İlk çocuk erkek, 3 yaşında ölmüş: Lisensefali El ayak deformitesi Solunum güçlüğü Mental retardasyon İkinci çocuk erkek, 1 yaşında ölmüş: Lisensefali

54 öneriler Multiple konj anomali nedenini açıklayabilir miyiz? her iki eşten kromozom analizi Dismorfik bozukluklar ve malformasyonlar açısından bir sendrom ile ilişki kurabilir miyiz? Sendrom databazlarında tarama(possum, OMIM vb.), hasta çocukların yapılan testleri ve bulgularının yeniden değerlendirilmesi için pediatri konsültasyonu

55 46,XX 450 bant 46, XY

56 Sonuçların değerlendirilmesi
Sitogenetik analiz sonucu normal Pediatri konsultasyonu ve sendrom taraması, her iki çocukta da benzer bulgular var, lisensefali ile giden sendromlar incelenmeli Miller dieker sendromu olabilir Bu sendrom LIS 1 genini içeren 17p13 del ile birlikte FISH ile mikrodelesyon taraması

57

58 Sonuç: Annede sitogenetik olarak saptanamayan 8q ve 17p arasında
gizli resiprokal translokasyon saptandı. Bu translokasyona bağlı olarak gelişen dengesiz gametlerin döllenmesi ile oluşan 17p13 delesyonu ve 8q trizomisi önceki çocuklarda saptanan bulguları açıklıyor. Sonraki gebelikler için risk mevcut

59 öneri Spontan gebeliklerde Mikrodelesyon sendromuna özgü
prob ile prenatal tanı Yardımlı üreme teknikleri ile invitro oluşan embriyoların Mikrodelesyon sendromuna özgü prob ile incelenerek dengeli embriyonun seçimi sonrası gebelik planlanması

60 Komperatif Genomik Hibridizasyon (CGH)
FISH’ den farklı olarak sağlıklı bireylerin metafaz kromozomları üzerine normal ve hasta bireyin hücrelerinden hazırlanan DNA probları kullanılarak hibridizasyon yapılmaktadır. Bir kaç baz çiftinden 10 Mb’ a kadar DNA parça kayıp ve /veya kazanımlarını saptayabilir. Uygulama sonucu elde edilen floresan görüntüleri mikroskopla değerlendirilemediği için görüntüler uygun kamera sistemi ile bilgisayarlara aktarılır. CGH yazılımları ile histogramda normale karşılık hasta hücresinin DNA kayıp ve /veya kazanımları değerlendirilir. Aynı anda tüm kromozomları inceleyebilir.

61 hasta DNA sı Kontrol DNA

62 Delesyon Delesyon, amplifikasyon gibi dengesiz yapısal anormallikleri saptar. Dengeli yapısal bozuklukları ve mozaikliği saptayamaz.

63 ARRAY CGH Klasik CGH den farklı olarak
metafaz plağına değil cam preparat üzerine yerleştirilmiş DNA parçaları (oligonükleotitler) ile hibridizasyon yapılır.

64 Array CGH kullanım alanları
*Kanser sitogenetiği *MR da subtelomerik delesyonların belirlenmesi CGH den daha duyarlı (1- 2 Mb) Aynı anda tüm genom taranır. Dez avantaj: Dengeli yapısal kromozom bozukluklarını saptayamaz Düşük oranlı mozaikliği saptayamaz Pahalı

65 MOLEKÜLER GENETİK DNA ve RNA molekülünün temel yapısı üzerindeki değişikliklerle veya bu yapının kendisiyle ilgilenir. Tek gen hastalıkları Mitokondriyel hastalıklar Üçlü Baz Tekrar hastalıkları Genomik yapıya ait polimorfizmler (SNP,VNTR,CNV) Metilasyon profilleri İfadelenme analizleri

66 MOLEKÜLER GENETİK YÖNTEMLER
DNA (Gen mutasyonları ve polimorfizmleri) Hibridizasyona dayalı yöntemler SOUTHERN BLOTLAMA Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) MUTASYON ANALİZLERİ Mikrodizilim (DNA çip) RNA (Transkripsiyon izleme yöntemleri) NORTHERN BLOT IN-SİTU HBİRİDİZASYON YÖNTEMİ “Reverse Transkriptaz” RT-PCR Mikroçip

67 Genomik DNA, çekirdekli hücreler içeren herhangi bir insan doku örneğinden ya da 10ml kadar venöz kandaki lenfositlerden kolayca elde edilebilir. Ayrıca postmortem doku parçaları steril kuru bir tüpe alınarak sıvı azot içersinde aniden dondurulur ve DNA elde etmek üzere -80C de saklanabilir. Blastomer, saç teli, sperm gibi tek hücrelerden, veya kurumuş kan örneği gibi az miktarda hücreden de DNA eldesi mümkündür. DNA eldesi için alınan kan ve ki örnekleri EDTA lı tüpe konularak Laboratuvara iletilmelidir.

68 Elde edilen DNA miktarının belirlenmesi için
spektrofotometre veya jel elektroforez kullanılabilir. Böylece DNA eldesinin başarılı olup olmadığı ve DNA kalitesi belirlenir. 260nm / 280nm : ise DNA da protein kontaminasyonu yoktur ve miktar olarak yeterlidir.

69 RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZLAR
Bakteriden elde edilen bu enzimler, DNA yı 4-6 baz uzunluğunda özgül nükleotid dizilerinden tanıma ve kesme yeteneğine sahiptir. Bu enzimlerinin bulunması ile DNA dizi analizleri yapılabilmiştir. Enzimle kesim sonrasında elde edilen DNA parçalarına restriksiyon parçaları adı verilmektedir.

70 Aynı DNA molekülü, belirli bir enzim kullanılarak kesildiğinde
her zaman aynı büyüklükte restriksiyon parçaları elde edilir. Kesilen DNA parçalarının büyüklükleri birbirinden farklı olduğu için agaroz jel elektroforezi kullanılarak birbirlerinden ayırt edilmeleri mümkün olabilmektedir.

71

72 Southern Blot Genomik DNA nın bir veya daha fazla restriksiyon enzimi ile kesimi Agaroz jel elektroforezi ile büyüklüklerine göre ayrımı DNA’nın nitro sellüloz membrana aktarılması, işaretli(radyoaktif maddelerle) probla ibridizasyonu, membranın yüksek ısıda kurutulması ve DNA bantlarının immobilizasyonu en son aşamada otoradyografi ile görüntüleme şeklindedir.

73

74 DNA parçaları arasında büyüklük farkı nedenleri;
baz çiftlik insersiyon veya delesyon benzeri herhangi bir genomik yeniden düzenlenme Restriksiyon kesim noktasında oluşabilecek tek bir baz değişimi sonucunda kesim noktasının ortadan kalkması Mutasyonla yeni bir kesim noktası oluşumu Tanı: Elektroforezle elde edilen bantlar, normalleriyle karşılaştırılarak mutasyonlar saptanır.

75 K H/E N/E K tK K K H E K Southern Blot ile FMR1 promotör bölgesindeki
CpG artışının metilasyon analizi ile gösterilmesi. Normal DNA EcoR1 enzimi ile kesilirken, Metile DNA Bst Z1 enzimi ile kesilir.

76 Denaturasyon, hibridizasyon ve DNA sentezi bir siklusu oluşturur.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); 1985 Kary Mullis DNA replikasyonu in-vitro koşullarda yapılır DNA çift zinciri yüksek ısı (95 C) ile birbirinden ayrılır (denaturasyon), sentetik oligonükleotidler hedef DNA’ya bağlanır 55-60C (hibridizasyon) ve zincir uzar (polimerizasyon, çift iplikli DNA sentezi) 72-76 C Denaturasyon, hibridizasyon ve DNA sentezi bir siklusu oluşturur.

77 PCR REAKSİYONU 1. DNA örneği, genellikle genomik DNA(25-50ng) 2. Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer 3. dNTP’ler (dinükleotid trifosfatlar; A,T,G,C) 4. Isıya dayanıklı DNA – polimeraz enzimi 5. Uygun pH ve iyon koşulları(Mg+2) sağlayan tampon karışımı

78

79 PCR KULLANIM ALANLARI 1. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcı ve hastanın tanısı 2. Restriksiyon parçalarının uzunluk polimorfizmi 3. Prenatal /Preimplantasyon(PGD) genetik tanı 4. Adli tıp (DNA parmak izi) 5. Onkogenezis 6. Prob sentezi, klonlama ve gen ekspresyonu 7. DNA dizi analizi

80 PCR Genin varlığını ya da yokluğunu gösterebilir
Nokta mutasyonları, üçlü tekrar artışlarını tanır Gen delesyon veya insersiyonlarını tanır Gen ifadelenmesi incelenebilir Gen dozajını belirleyebilir (real time PCR) Bilinen mutasyonların tanısında kullanılabilir Aynı anda birden fazla gen incelenmesi için geliştirilmiş teknikler gereklidir. MLPA Quantitative Fluorescent PCR (QF PCR) Real Time PCR (RT PCR)

81 m h +k h hh +k -k m PCR ile çoğaltılan GAA tekrarlarının %1.5 agaroz jelde yürütülmesi sonucu analizi.

82 Quantitative Fluorescent PCR ( Q-F PCR)
13, 18, 21, X ve Y kromozomları üzerindeki mikrosatellit (değişken sayıda tandem tekrarlayan dinükleotidler, AC-GT gibi) kullanılarak allel dozajı belirlenir. Yapısal anormallikleri gösteremez Düşük oranlı mozaikliği gösteremez Tarama için kullanılır, kısa sürede ön bilgi verir.

83 DNA Parmak izi Adli Tıp uygulamaları, kriminal/ babalık testi
Değişken büyüklükte tekrarlayan DNA dizileri (10-15 bç), Minisatellitler, kullanılır

84 DNA dizi analizi , Fred Sanger Moleküler tanıda altın standart
Dideoksinukleotidler kullanılır.

85 Otomatik DNA dizi analizi,
Nukleotidler Floresan boyalarla boyanarak Sonuçları bilgisayarda analiz edilir. Genin içerdiği tüm mutasyonlar taranabilir. Sadece dizisi bilinen genleri tarayabilir.

86 DNA mikrodizilim “Mikroarray”
Hem normal hem de bilinen ya da olması muhtemel tek nükleotid değişikliklerini içeren 20-25bç lik oligonükleotidler bir çip üzerine yerleştirilmiştir. PCR ile çoğaltılan DNA, mutasyon analizi için Floresan boyalarla işaretlenerek, mikroarray deki oligonükleotidlerle hibridize edilir. Sonuçlar bilgisayar programı ile analiz edilir.

87

88 “Mikrodizilim” teknolojisinin uygulama
alanları Adli Tıp İnsan genom araştırmaları Kişisel tıp Dizi analizi Tek nükleotid polimorfizmi (SNPs) Sitogenetik

89 RNA ELDESİ Bir genin varlığını bilmek, onun fonksiyonel olduğunu göstermez fonsiyonu göstermek için transkripsiyonu incelenmelidir. DNA mRNA cDNA Taze doku örnekleri Arşiv materyali (parafin blok)

90 Northen Blotlama İlgilenilen dokudan elde edilen mRNA lar kalıp olarak
kullanılmaktadır. *mRNA agaroz jelde yürütülür *filtreye aktarılır *işaretli prob ile hibridize edillir *İlgilenilen dokuda hedef genin ifadelenip İfadelenmediği, *İfadelenme düzeyleri *Hedef gende olan/olması muhtemel mutasyonlar sonucunda oluşan mRNA daki büyüklük farklılıkları

91 Reverse Transkriptaz-PCR
RNA cDNA PCR RNA eldesi için taze dokudan en kısa zamanda çalışma gerekli!

92 MİKROÇİP Cam veya naylon yüzeyler üzerine kısa ve RNA sentezinde hücrenin kullandığı hedef diziler dizilidir. İncelenecek örnekten mRNA elde edilir ve RT ile cDNA’ya çevrilir, radyoaktif veya floresan molekül ile işaretlenir. Örnekler çip ile hibridize edilir.

93 Bağlantı analizi Bilinmeyen gen ya da mutasyon varlığında kullanılır.

94 Rekombinant DNA teknolojisi ve hücresel klonlama
DNA- cDNA kütüphanelerinin hazırlanması, prob hazırlama

95 Genetik haritaların oluşturulması

96 Doğru bilgi Doğru yöntem Uygun danışmanlık

97 KAYNAKLAR: