Bekir Col, Ph. D. Mugla Universitesi

... konulu sunumlar: "Bekir Col, Ph. D. Mugla Universitesi"— Sunum transkripti:

1 Random Amplified Polymorphic DNA (Rasgele Cogaltilmis Polimorfik DNA) RAPD
Bekir Col, Ph. D. Mugla Universitesi Mart Molekuler Entomoloji Kurs Notlari

2 Tarihsel Perspektif Karl Mullins’in PCR i kesfetmesinden sonra, kisa primerlerin genom DNAsinda birkac yere baglanabilecegi fark edildi. 1990 Williams ve ark. RAPD teknigini gelistirdi. Bu teknik ile 10 nukleotidlik primerler ve kalip DNA kullanilarak rasgale PCR urunleri elde edilebiliyordu . RAPD fragmenleri ayirt edilerek, genetik markorler olarak kullanilabildi. Sonradan buna Molekuler Markorler dendi. (bir cesit DNA parmak izi!) RAPD teknigine yakin teknikler: DNA Amplification Fingerprinting (DAF) - Caetano-Anolles et al. (1991) 8 nt buyuklugunde primerler kullandi Arbitrary Primed PCR (AP-PCR) - Welsh and McClelland (1990) daha buyukce primerler kullandi ama primer baglanma kabiliyetini diger kosullarla oynayarak arttirdi.

3 Polymorphic DNA ne demektir?
"poly" = "many" "morphic" = "shapes" (Bir cok sekil) DNA dizisi turler arasinda ve ayni turun farkli bireyleri arasinda goreceli olarak cesitlilik gosterir. Genom DNA sindaki bazi DNA bolgeleri daha fazla korunmustur yani cesitlilik gostermez. Bu DNA bolgeleri biyolojik cesitliligin anlasilmasinda kullanilmaz. Ama bazi DNA bolgeleri bireyler arasinda orta derecede ya da cok derecede FARKLILIK gosterebilir. Bu DNA bolgeleri Biyolojik cesitliligi anlamak acisindan daha kullanilislidir. Bu DNA bolgeleri RASGELE olarak RAPD primerleri ile avlanabilir. Ya da alternatifler teknikler vardir. Microsatellite DNA bolgeleri gibi. (Baska bir dersin konusu)

4 Standard PCR ile RAPD PCR arasindaki fark
RAPD analysis, the target sequence(s) (to be amplified) is unknown. Design a primer with an arbitrary sequence. simply make up a 10 base pair sequence carry out a PCR reaction and run an agarose gel to see if any DNA segments were amplified in the presence of the arbitrary primer.

5 Primerlerin baglandiklari yerler acisindan birbirine bakmasi gerekir
Primerlerin baglandiklari yerler acisindan birbirine bakmasi gerekir. Ve iki primer arasindaki mesafenin makul bir uzaklikta olmasi lazim (1-3 kb gibi) RAPD reaksiyon #1: Oklar primerleri isaret ediyor. Okun yonu extension (uzama) yonunu isaret eder. Rakamlar primerin baglanma bolgelerini isaret eder. 1, 2 ve 3 numaralari boglede primerler asagidaki DNA iplikcigive baglanir. 4,5, ve 6 numarali bogedeki primerler ise ustteki DNA iplikcigindeki tamamlayici bolgeye baglanir Ornegin burada sadece 2 tane PCR urunu jelde gozlemlenir. Neden? 2 ile 5 primerleri urun A yi, 3 ila 6 ise urun B yi olusturur. 1 ila 4 bir urun olusturmaz cunku iki orimer birbirine baksalarda birbirinden cok uzaktalar. 4 ila 2 bir urun olusturmaz, cunku ters yone bakkiyorlar. Ha keza 5 ila 3 te de durum boyledir.

6 RAPD analizi ile genomlar arasinda fakliliklarin bulunmasi
Onceki slayttaki durumu dusunun. O bir bireyden elde edilmis DNA olsun. Asagidaki Ise baska bir bireyden. Senaryo soyle olabilir. RAPD reaksiyon #1: Figurde goruldugu gibi 2 numarali primer baglanma bolgesi bu bireyde bulunmuyor. Yani orada polimorfizm var. Burara artik primer baglanamayacak ve 2 ile 5 in olusturudugu PCR urunu gorulmeyecek. Sadece 3 ile 6 nin olusturdugu urun gorulecek.

7 Sonuc: Eger bir 2 RAPD PCR sonucunu agoroz jel elektroforezinde analiz etseydik
Asagidakini gorurduk

8 RAPD Primer kalip DNA uzerinde bir suru yere baglanir.
Ama sadece birbirine yakin ve 3’OH uclari birbirine bakan primerler PCR sonucu gozlemlenebilen urun DNA verebilirler.

9 RAPD Primerler ters yone baktigi icin gozlemlenebilir urun olusturmaz
KALIP DNA Primerler ters yone baktigi icin gozlemlenebilir urun olusturmaz

10 RAPD Primerler ayni yone baktigi icin amplifikasyon (cogaltma olmaz
KALIP DNA Primerler ayni yone baktigi icin amplifikasyon (cogaltma olmaz

11 RAPD KALIP DNA > 2,000 bases Primerlerin baglanma yerleri birbirinden cok uzak. Amplifikason yok

12 RAPD KALIP DNA Primerlerin birbirine olan uzakliklari makul. Amplifikasyon olabilir ,500 bp

13 Agaroz jeldeki RAPD Banlari
4mM MgCl2 1.2 U Taq 5 pM OPA-16 4mM MgCl2 0.6 U Taq 10 pM OPA-16 2mM MgCl2 1.2 U Taq 10 pM OPA-16 RAPD reaksiyonlari 3 lu tekrar olarak yapildi. Primer ve kalip DNA ayni ama magnezyum kons., polimeraz miktari ve primer kons degistirildi. Hangi degisken BAND PATERNLERINI en cok etkiler? M Magnezyum iyon konsantrasyonunu azaltmak en buyuk PCR bandinin sentezlenmemesine neden oldu. 2-7 de var, 8-10 da yok.

14 Show animation at: RAPD

15

16 Ornek RAPD primerler

17

18 Group I was established between pairs I029-I040 and I021-I032 joined by isolates I031, I026, I007, I041, I043, and I023. Group II comprised pair I004-I014, and isolates I033, I018, I012, I003, I006, I022, I030. Isolate I017, which forms group III, showed a banding pattern significantly different from the

19