SPERM VE TESTİS DOKUSU DONDURULMASINDA ÖNEMLİ NOKTALAR

... konulu sunumlar: "SPERM VE TESTİS DOKUSU DONDURULMASINDA ÖNEMLİ NOKTALAR"— Sunum transkripti:

1 SPERM VE TESTİS DOKUSU DONDURULMASINDA ÖNEMLİ NOKTALAR
Doç.Dr. M. Ertan Kervancıoğlu

2 Sperm ve Testis Dokusu Dondurma Endikasyonları
Nesil ıslahında Kemoterapi sonrası fertilitenin sağlanması Fertilitenin garantiye alınması ICSI için yapılan TESE den artan örnekler Soyu biten hayvanların çoğaltılmasında

3 Fare spermi ICSI için, 800 mOsmol KSOM-BSA medyumu içinde oda ısısında 1 hafta ve -20 derecede 3 aya kadar saklanabilmektedir Thuan et al 2005

4 TARİHÇE Karda sperm dondurdu (Spallazani ve ark. 1776) .
Gliserol freezingde kullanıldı (Polge ve ark. 1949). Kuru buzda sperm basarılı donduruldu (Bunge ve Sherman 1953). Sıvı Azotta sperm başarılı donduruldu (Sherman ve ark. 1963). Dondurulup çözülmüş testiküler sperm ICSI de kullanıldı (Romero 1996).

5 CRYOPROTEKTANLAR PERMEATING Dimethyl Sulfoxid Propilen Glikol (PROH)
Gliserol Ethylene Glikol NON- PERMEATING Sukroz Rafinoz Glisin

6 DONDURMA Azot Buharı Komputer Kontrollu Vitrifikasyon ÇÖZME Hızlı Komputer Kontrollü

7 AVANTAJLARI DEZAVANTAJLARI AMPUL Doldurma Hacım Sealing Depolama STRAW Seeding Kırılma ENJEKTOR Kullanıma Hazır

8 Bir hücrenin dondurmaya hassasiyeti boyutuna, hidratasyon durumuna, membran geçirgenliğine ve siklus fazına bağlıdır.

9 FREEZİNG ETKİNLİĞİ Motilite tayini Plasma membranındaki hasar
Akrozomal hasarlar Biokimyasal markerler Fertilite sağlanması

10

11 TYB ıle slow freezıng planer ıle dıgerı aynı medıa dırekt vıtrıfıcatıon sonuc aynı yayın ozetten
Chang HS et al 2008

12 Irwıne scıentıfıc ın klasık metodu ıle

13 F 90 pellet kıyaslama 37 derece ıle yapılmıs Irwıne klasık freezıng metod

14 De Paula et al 2006 An increase in apoptotic DNA fragmentation was observed in all the groups, regardless of sperm concentration. Normozoospermic men presented a smaller rate of apoptotic DNA fragmentation than oligozoospermic patients, both in pre- and postcryopreservation samples. The increase in DNA fragmentation was similar in both groups. Conclusion(s): Cryopreservation induces apoptotic sperm DNA fragmentation in men, regardless of sperm concentration. Men with oligozoospermia present with higher precryopreservation and postcryopreservation apoptotic sperm DNA fragmentation. The increase in DNA fragmentation is similar in both groups.

15 Normospermik ve oligospermik sperm 3 defa dondurulup çözülebilir
Normospermik ve oligospermik sperm 3 defa dondurulup çözülebilir. Hareketli, normal ve canlı sperm elde etmede Yavaş veya hızlı dondurma Yıkanmış veya yıkanmamış semen dondurma Yıkanmış ve seminal plasma eklenmiş arasında anlamlı bir fark yoktur. Bondularatne ve Bongso 2002

16 Spermin seminal plasma ile beraber dondurulmasında çözme sonrası motilite ve DNA bütünlüğü daha iyi korunur. Donnelly ve Ark. 2001

17 Degısık ZP icinde sperm toplamada recory asagı yukarı aynı FREEZING % 60 GLYSEROL ILE STRAW ICINDE VE KLASIK BUHARDA DONDURULMUS

18 TYB Zona İçine Sperm 1 88 Motilite 32 26 Fertilizasyon Oranı 13.8 23
Borini ve Ark. 2000

19 BACKGROUND: With the availability of ICSI, men with severe oligozoospermia (<53106/ml) are able to reproduce. Current methods for cryopreservation of severe oligozoospermic samples are labour intensive and costly. The objective of this study was to evaluate whether freezing small numbers of motile sperm (~100) was feasible using cryoloops. METHODS: Initial tests assessed the effect of various dilutions of cryoprotectants on pre-freezing sperm motility. Several solutions were further evaluated for their ability to cryoprotect sperm during ultra-rapid freezing. Sperm were placed on cryoloops and held in liquid nitrogen vapour for 5 min prior to freezing (ultra-rapid freezing) or directly submerged into liquid nitrogen. Using the optimal cryoprotectant and technique from these experiments, ultra-rapid and standard slow-rate freezing protocols were compared. RESULTS: Optimal sperm survival was seen when sperm in cryoloops were placed in liquid nitrogen vapour in test yolk buffer with 12% v/v glycerol versus other cryoprotectants. Using this cryoprotectant, post-thaw sperm motility is comparable between ultra-rapid and slow-rate freezing methods. CONCLUSION: Ultra-rapid freezing of very low numbers of sperm is feasible using cryoloops suspended in liquid nitrogen vapour for 5 min. TG SCHUSTER et al 2003

20 Cryoprotectant-Free Cryopreservation of Human Spermatozoa
by Vitrification and Freezing in Vapor ISACHENKO ET AL 2004 Motility and DNA integrity of spermatozoa after cryoprotectantfree cryopreservation with rapid (vitrification) and slow (freezing) coolings. No differences between respective rates of vitrified and frozen spermatozoa. Our findings suggest that optimal regimes for the cryoprotectant-free cryopreservation of spermatozoa need not be restricted to very fast cooling before storage in liquid nitrogen, a wide range of cooling rates being acceptable. Herein, we discuss the implications of this finding in the light of the physics of extra- and intracellular vitrification.

21 97 frozen tesenın 77 sınde sperm bulunmus
Verheyen G 2004

22 Verheyen G 2004

23

24 Fertiliteyi koruma yöntemlerinde onkoloğun görevi
İnfertiliteyi tedevinin potensiyel bir riski olarak hastanızla tartışın. Fertiliteyi koruma işlemlerinin kanser terapisinin başarısını düşürmesi, maternal yada perinatal komplikasyonları artırması ve bebeğin sağlığını tehlikeye atacağı ile ilgili temel cevapları verin. Hastaları üreme uzmanları psikolojik danışmanlara yönlendirin.

25 Sperm cryopreservation in oncological patients: a 14-year follow-up study

26 Her sene 4000 çocuk steril olmalarına sebep veren kanser tedavisi görüyor
Yılda ortalama 15 ile 35 yaş arası 9100 erkeğe testis kanseri, Hodgkin’s lenfoma ve lösemi teşhisi konuyor

27 Testis hücre karışımının uzun bir süre için dondurabileceği ve çözülmesi sonrası spermatogenezisi başlatabileceği gösterildi Avarbock ve Ark 1996

28 Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.
Brinster et al ( )

29 Transplantasyonda genellikle her testis için 10 mikrolitrelik hacim kullanılır.
Tavsiye edilen hücre yoğunluğu /ml hücredir. Yaklasık olarak transplante edilen hücrelerin % 10 u kolonize olur.

30 Spermatogenezis lateral olarak tubul içinde her iki yöne doğru ilerler ortalama ilerleme hızı mikron/gun. Transplantasyondan yaklasık 1 ay sonra spermatosit kolonileri, 2 ay sonra olgun spermatozoon 3 ay sonrada testisin % 30 unda spermatogenez gözlenmektedir.

31 Germ hücre transplantasyonu için hazırlanan testis dokusunun kriyoprezervasyonunda uygun tekniğin araştırılması Doç.Dr.E.Kervancıoğlu Dr.A.Arvas Doç.Dr.S.Solakoğlu Dr.O.Karabulut

32 Hücre izolasyonu HBSS içine %10FCS,2mM glutamine,6mM lactate,0,5mM pyruvate ile ana solusyon hazırlandı. Testisler 1mg/ml collegenase tipIV içinde 37 C da 15 dakika bekletildi. 7mg/ml DNAse içeren solusyondan üzerine eklenerek tübüller ayrıldı ve daha sonra HBSS içinde yıkandı. %0.25 trypsin ve 1 mM EDTA Tübüllerin üzerine eklendi ve 37 C da 10 dakika bekletildi.Üzerine enzimin işlevini durdurmak üzere 1 ml FBS eklendi. Hücreler yıkandıktan sonra 50 milyon/ml hücre olacak şekilde resüspanse edildi.

33 Germ hücrelerinin dondurulması ve çözülmesi
Kryoprotektan olarak DMSO ve Glyserol kullanıldı. 1.Dondurma metodu -70 C da 12 saat sonrası sıvı nitrojene alındı. 2.dondurma metodu Planer Kryo 10 da embryo freezing programı uygulandı. 1.çözme metodu 37 C da çözülüp,üzerine 3 kat ana solusyondan eklendi.500Xg de santrfüje edilip,resüspanse edildi. 2.çözme metodu oda ısında çözülüp üzerine 1 ve 0,5 M dilüe solusyonlar ile 5 er dakika yıkandı,500Xg de santrifüje edilip,resüspanse edildi.

34

35

36

37 Normal structure was seen in 8666% (mean 6SD) of the fresh tissue
Normal structure was seen in 8666% (mean 6SD) of the fresh tissue. After freezing with DMSO, 7066% and after PrOH, 3763% of the tubules were judged to be good.When glycerol was used, the structure of the basal compartment of the tubules was severely damaged. The ultrastructure of the cryopreserved samples as revealed by TEM and MAGE-positive spermatogonia confirmed the findings. Cryopreserved Leydig cells maintained their morphology and ability to release testosterone in culture. CONCLUSION: DMSO as a cryoprotectant (at a 0.7 mol/l concentration) proved to maintain the structure of testicular tissue, especially spermatogonia, after cryopreservation better than PrOH or glycerol. Keros et al 2005

38 Keros et al 2005

39

40 Honaramooz, A. et al. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature, 418, , (2002). Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature, 418, , (2002).

41 SAKLAMA SÜRESİ Metabolik prosses yavaştır Akkümüle kozmik radyasyon
Geçici ama tekrarlayan ısı değişiklikleri

42 PROBLEMLER Bir donorden dört alıcının HIV enfeksıyonu (1980)
Kemik iliği transplantında 6 hastada Hepatit B (1995)

43 TEMİZLİK Tankların rutin temizliği Soğutucu aletlerin temizliği
Gametler için uygun temizleyici Kaçaksız straw

44 Uyguladığımız Protokol
Ağzı vidalı ependorf freezing tüpünde Etiketleme için özel kalem Normal ve oligospermik örnekte glyserol ile klasik freezing NOA önce semen alıp seminal plasma içerisinde doku ve sıvı ayırarak Testiculer doku DMSO ile Çözme semen oda ısısında

45 SONUÇ SEMEN VE TESTİS DOKUSU DONDURULMASI MATERYAL BULUNMASI VE ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASININ KOLAY OLMASI DOLAYI İLE HER LABORATUARIN KENDİNE GÖRE BİR PROTOKOL HAZIRLAMASI GEREKMEKTEDİR.