AFLP VE DNA DİZİLEME DENEYSEL AŞAMALARININ KARŞILAŞTIRILMASI

... konulu sunumlar: "AFLP VE DNA DİZİLEME DENEYSEL AŞAMALARININ KARŞILAŞTIRILMASI"— Sunum transkripti:

1 AFLP VE DNA DİZİLEME DENEYSEL AŞAMALARININ KARŞILAŞTIRILMASI

2 KONU İÇERİĞİ AFLP Tanımı AFLP Aşamaları
AFLP Avantajları Ve Dezavantajları DNA Dizileme Tanımı DNA Dizileme Avantaj & Dezavantajları AFLP Ve DNA Dizileme Karşılaştırılması

3 AFLP

4 AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) Nedir
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) Nedir? (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizimi)

5 Genomik DNA’nın restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluşan DNA parçalarının bir grubunun selektif amplifikasyonu (seçici yükseltme) esasına dayanan bir genotipleme metodudur. Bu yöntem ‘selective restriction fragment amplification (SRFA)’ olarak da bilinir.

6 Bu yöntem PCR dayanarak 1995 yılında Vos ve ark
Bu yöntem PCR dayanarak 1995 yılında Vos ve ark. tarafından bulunmuştur, RFLP ve PCR kullanımı tekniklerini içerir, AFLP kullanılan RFLP den daha hızlı, Daha az emek ister , Daha fazla bilgi sağlar, RAPD’ e oranlada tekrarlanabilirliği fazladır.

7 KULLANIM ALANLARI Genom haritaları Bireysel genotipin tanımlanması
DNA polimorfizminin saptanması Kantitatif özellik lokuslarının saptanması Ebeveyn ve akrabaların tespiti Hastalık ve genetik defektlerin teşhisi Adli tıpta

8

9 AFLP tekniği, RFLP tekniğinin kesme-tanıma kısımlarının PCR ile çoğaltılmasına dayalı bir DNA markır tekniğidir. Çoğaltılan parça uzunluğu farklılığı veya polimorfizmi anlamına gelen AFLP tekniği, RAPD tekniğini ile RFLP tekniğinin birleştirilmiş formu olup RAPD tekniğinin dezavantajlarını gidermek üzere geliştirilmiştir.

10 AFLP, toplam DNA’nın kesildikten sonra PCR reaksiyonuyla çoğaltılması esasına dayanan güçlü bir tekniktir. Bu teknikte genomik DNA genellikle önce birisi altı, diğeri dört bazı tanıyan iki kesim enzimi (RE) tarafından kesilir.

11 Kesilen parçaların uçlarına nükleotid dizilişi sentetik olan DNA’lar eklenir (Adaptör).
Eklenen sentetik DNA`nın yani adaptörün nükleotid dizilişini de taşıyan başlatıcı DNA`lar yani primerlerin kullanımıyla nispeten spesifik DNA çoğaltımı yapılır.

12 Bu çoğaltma iki aşamada gerçekleşir
Bu çoğaltma iki aşamada gerçekleşir. İlk aşamada her iki uçtan DNA kesim enzimlerinin tanıdığı diziden sonraki ilk nükleotide göre seçici çoğaltımın yapıldığı ön üretim yapılır. Asıl üretimde ön üretimde elde edilen parçaların kullanımıyla kesim enzimi tanıma yerinden sonraki ikinci ve üçüncü nükleotidler için seçici üretim yapılır.

13 Bütün başlatıcılar sentetik uçların nükleotid dizilişini de taşıdığı için üretim oldukça spesifik şartlarda yapılmış olur. Üretilen parçacıklar bir baz uzunluğu farklarını dahi ayırt edebilen poliakrilamid jel üzerinde hareket ettirilerek farklı genotiplere ait farklılık gösteren parçacıklar tesbit edilir.

14

15 AFLP ANALİZİNİN BASAMAKLARI
Genomik DNA’nın Restriksiyon Enzimleriyle Kesilmesi Çift sarmallı Adaptör Sekanslarının Restriksiyon Enzimlerinin kesmiş olduğu kısımlara eklenmesi Ön-Seçici PCR Seçici PCR

16

17

18

19

20

21 AVANTAJI Tek bir reaksiyonda 30-150 bölge tanımlanabilmesi.
Sonuçların tekrarlanabilir olması en önemli avantajını oluşturmaktadır.

22 DEZAVANTAJI Dezavantajı ise pahalı olması,
Labaratuvar ekipmanına gereksinim duyulması ve Dominant markör olmasıdır.

23

24 DNA DİZİLEME

25 DNA birincil yapılarının tayininde ve nükleotid baz diziliminin belirlenmesinde kullanılan yöntemdir. Sıklıkla gen mutasyonları (delesyon, insersiyon vb.) tespiti yada rekombinant DNA oluşum yapılarının tayininde kullanılır. Ayrıca gen regülasyonunda yer alan genetik kontrol bölgeleri,konsensus dizileri, epistatik genler ve etkileri belirlenebilmektedir.

26 DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi sağlamıştır. Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNA elde edilmesini sağlayan rekombinant DNA tekniklerinin gelişmesine paralel olarak DNA dizi analizi yöntemleri de gelişme göstermiştir.

27 DNA DİZİLEME YÖNTEMLERİ

28 DNA dizi analizi ya da "Sequencing" DNA'nın nükleotid dizilerinin saptanması anlamına gelmektedir.
İlk dizi analiz çalışmaları 1960’lı yılların başında nükleotitlik tRNA’larla başlanmıştır.

29 DNA DİZİLEME

30 Nükleotit dizilerinin belirlenmesinde iki temel teknik kullanılmaktadır.
Sanger dideoksi yöntemi Maxam-Gillbert kimyasal degredasyon yöntemi

31 TARİHÇE DNA’nın 3 boyutlu yapısı, 1953 yılında tanımlandıktan sonra dizi analiz çalışmalarına öncülük oluşturacak ilk denemeler küçük RNA parçaları ile çalışılmış olup, Robert Holley tarafından 1965 yılında tRNA molekülünün dizi analizi yapılmıştır. 1977 yılında Allan Maxam-Walter Gilbert ve Sanger tarafından iki farklı DNA dizi analiz yöntemi bulunmuştur. Otomatik dizi analiz cihazları 1985 yılından itibaren geliştirilmiştir.

32 Her iki teknik de üç temel basamaktan oluşmaktadır.
DNA’nın hazırlanması Reaksiyonlar Yüksek voltajlı jel elektroforezi

33 DNA DİZİLEME YAPILIRKEN DÖRT AYRI REAKSİYON KARIŞIMI HAZIRLANIR
Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiye nükleotit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA fragmenti meydana gelir.

34 MAXAM-GİLBERT YÖNTEMİ (Kimyasal Kırılma Yöntemi)
Bu yöntemin prensibi hidrazin, dimetil sülfat ya da formik asitin, DNA’ da bulunan bazları özgül olarak değiştirmesine ve daha sonra eklenen piperidinin değişikliğe uğramış nükleotidlerin bulunduğu noktalardan zinciri kırmasına dayanır.

35

36

37 SANGER-COULSON YÖNTEMİ (Zincir Sonlandırma Yöntemi)
Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır. Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.

38 Bu yöntem için: Tek iplikli kalıp DNA’ya dNTP’lere ddNTP DNA polimeraz Serbest OH grubu içeren primere ihtiyaç vardır.

39

40

41 AFLP DNA DİZİLEME DAHA PAHALIDIR.
DAHA UCUZDUR. ( KULLANILAN ENZİMLERE BAĞLI ) DAHA UZUN SÜRE ALIR. DAHA KISA SÜREDE SONUÇ VERİR. AFLP’ DE ADAPTÖR LİGASYONU VE SEÇİCİ PCR VAR. ADAPTÖR LİGASYONU VE SEÇİCİ PCR YOK. NORMAL PCR VAR. JEL ELEKTROFOREZİ VARDIR. UYGULAMASI ZORDUR. UYGULAMASI DAHA KOLAYDIR. AFLP DE KLONLAMA YAPMA DAHA FAZLADIR. AFLP YE GÖRE DAHA AZ KLONLAMA YAPILIR. İZOLASYON VARDIR İZOLASYON VARDIR.

42 KAYNAKÇALAR