Faydalı olması dileğiyle…

... konulu sunumlar: "Faydalı olması dileğiyle…"— Sunum transkripti:

1 Faydalı olması dileğiyle…
ELEKTROFOREZ Etkin Kimyagerler Eğitimleri Faydalı olması dileğiyle… Yüksek Kimyager Hasan ÖZ

2 ELEKTROFOREZ Elektroforez,doğru akımın uygulandığı bir tampon çözeltide yüklü taneciklerin diferansiyel göç hızlarına dayanan bir ayırma yöntemidir. Yüklü türlerin, içinden elektrik akımı geçirilen bir elektrolitte çözündükleri veya süspande olduklarında göç etmeleri esasına dayanır. Kapiler Zone Elektroforez

3 Giriş İletken bir çözelti içindeki yüklü/yüksüz parçacıkların veya moleküllerin bir elektriksel alan varlığında göç etmesi söz konusudur. Elektroforez için dört şeye ihtiyac vardır: iyonların hareket edebileceği uygun bir ortam (destek ortamı) uygun pH’da bir tampon çözelti elektriksel alanı oluşturmak icin doğru akım sağlayacak güç kaynağı birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak değerlendirebilen dedektör

4 Tarihçe Bu ayırma yöntemi ilk olarak İsveçli kimyacı Arne Tiselius tarafından serum proteinleri üzerinde çalışırken bulunmuş ve çalışma dolayı kendisi 1948'de Nobel Ödülü ile ödüllendirilmiştir. Elektroforezin kapilerde gerçekleştirilmesinin avantajları 1980’lerin başlarında Jorgenson ve Lukas’ın çalışmaları ile belirginleşmiştir.

5 1897-Kohlrausch-elektrolit içindeki iyonların göçü
Hjerten–CZE terimi,1-3 mm iç çaplı kuartz kapiller Virtanen-0,2-0,5 mm iç çaplı kapiller Everaertsve Hoving–Keulemans-politetrafluoroetilen kapiller(0,5 mm ID) organik asitlerin isotakoforetik ayrımları Jorgensonve Lukacs-75 μm ID açık cam kapiller Terabe-Kapiller elektrokinetik kromatografi Microphoretic Systems,Applied Biosystems, Beckmann, Bio-Rad Laboratories, Spectrovision.

6 Ayrılma bileşiklerin;
Yük/kütle oranına göre, Afinitilerine göre, Partikül büyüklüklerine göre, Hidrofobik özelliklerine göre, Absorbsiyon özelliklerine göre gerçekleşir.

7 ELEKTROFORETİK AYIRMALARIN TEMELİ
İYON GÖÇ HIZI v= µe E V: iyon göç hızı μe: elektroforetik mobilite E: Elektrik alan μe: elektroforetik mobilite q : iyon yükü ƞ:çözelti vizkositesi r:iyon çapı Elektroforetik mobilite verilen iyon ve çözelti için bir karakteristiktir ve sabittir.

8 v= µe E eşitliğinden çıkarılanlar:
Elektroforetik hareketlilik analitin iyonik yükü ile doğru ve sürtünmeli geçiktirme katsayısı ile ters orantılıdır. Elektrik alan sadece iyonlar üzerine etkilidir.Nötral türler birbirinden ayrılamazlar. Eğer iki farklı tür hem farklı iyon yüküne ve hem de tampondan geçerken farklı sürtünme kuvvetine sahipse,bu iki madde birbirinden ayrılabilir. Analit iyonun sürtünmeli geçiktirme kuvveti ,o iyonun boyutuna,şekline ve içinde göç ettiği ortamın viskositesine bağlıdır.

9 Elektroforetik ayırmanın temelleri
Aynı boyuttaki iyonlar için;yük ne kadar büyükse,yürütücü kuvvet ve göç hızı o kadar büyük olur. Aynı yükteki iyonlar için ise ,iyon küçüldükçe sürtünme kuvveti küçülür ve göç hızı artar. İyonun iyon/yük oranı bu iki etkiyi birleştirmektedir. Kromatografinin aksine elektroforetik ayırmada tek faz söz konusudur.

10 ELEKTROFOREZ TİPLERİ KLASİK YÖNTEM KAPİLER ELEKTROFOREZ
1. Kağıt elektroforezi 2. Selüloz asetat elektroforezi 3. Jel elektroforezi a. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) b. Agaroz jel elektroforezi 1.Kapiler Bölge Elektroforezi (CZE) 2.Kapiler Jel Elektroforezi (CGE) 3.Kapiler İzoelektrik Odaklama (CIEF) 4.Kapiler İzotakoforez (CITP) 5.KAPİLER ELEKTROKROMATOGRAFİ a.Dolgulu kolon Elektromatografi b.Micellar Elektrokinetik Kapiler Kromatografi (MECC-MEKC)

11 Klasik Yöntemler Kağıt ve Selüloz Asetat Elektroforezi
Kağıt tampon çözelti ile doyurulduktan sonra, iki ucu tampon çözeltiye batacak şekilde gerilir. Örnek madde kağıt üzerine genellikle bir çizgi halinde sürülür. Kurumaması için kağıt hem üstten kapatılır hem de bir su deposu üstünde tutulur. Gerilim uygulandıktan sonra bir süre bekletilir, süre tamamlandığında kağıt çıkartılır, kurutulur ve analiz edilir.

12 Kağıt ve selüloz asetat elektroforezi
Yüksek voltajlı kâğıt elektroforezi en çok peptitler ve aminoasitlerin ayırt edilmelerinde kullanılmaktadır.Selüloz asetat elektroforezi ise öncelikle serum proteinlerinin elektroforezinde önemlidir. Jel Elektroforezi -Poliakrilamid Jel Elektroforezi: PAGE; serum proteinlerinin, proteinlerin genetik varyasyonlarının ve izoezimlerin analizinde en iyi sonuç veren elektroforez tipidir. Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez, örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrışmasına yol açar. Çünkü ayırım hem moleküler elekleme, hem de elektroforetik harekete dayanır.

13 Jelin ayrıştırma gücü ve molekül boyutu aralığı akrilamid ve bis akrilamid konsantrasyonuna bağlıdır.İki maddenin polimerizasyonu ile jelde porlar olusur. Düşük konsantrasyonda daha büyük porlar oluşur ve yüksek molekül ağırlıklı moleküllerin analizi yapılabilir.Yüksek konsantrasyonlarda ise kücük porlar oluşur ve düşük molekül ağırlıklı moleküllerin analizi yapılır.

14 Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta(0,5-2,0 mm) tutulan iki cam tabaka arasında ve genelde 8-10 cm ya da cm boyutunda hazırlanır. Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar.Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır. Kuyucuklar, tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere, tamponla yıkanır. Jel kaseti iki tampon arasına yerleştirilir;kuyucuklara örnekler konulur ve akım geçirilir.Uygun boya ile boyanır.

15 Agaroz Jel Elektroforezi
Serum proteinleri, hemoglobin varyantları, LDH izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonları ve diğer maddelerin analizi için başarıyla uygulanmaktadır. Agaroz sıcak suda çözünür, soğutulduğu zaman, karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür. Örnekler, jel içine yapılan küçük kesilerle oluşturulan kuyucuklar içerisine uygulanırJelin uçları daha sonra içine elektrodlar yerleştirilmiş ayırıcı tampon tankına daldırılır.Elektrodlar arasında bir akım oluşturan bir voltaj uygulanır. Jelden geçen bu akım genellikle 30 dakika civarında sürer ve istenen rezolüsyonu sağlar. Tamponun iyonik gücü akım miktarını ve sabit bir voltajda proteinlerin hareketini sağlar. Eğer iyonik güç azsa nispeten daha çok akım yüklü proteinler tarafından taşınır.

16 İyonik güç fazlaysa daha az akım daha kısa mesafeye hareket eden proteinler tarafından taşınır. Jelin iletken tamponla teması düzensizse akım elektrodlar arasında farklı olabilir, proteinler daha fazla akım olan yöne daha çok göçer. Elektroforez süresi çok uzun tutulacak olursa proteinler jelden tampon iç içe göçer. Elektroforezden sonra jel asetik asit gibi hafif bir fiksatifle muamele edilir ve proteinler göç ettikleri yerlerde çökerler. Daha sonra boyanır, jel kurutulur ve zemini açılır.

17

18 KAPİLER ELEKTROFOREZ

19 KAPİLER ELEKTROFOREZİN AVANTAJLARI

20 KAPİLER ELEKTROFOREZDE AYRIMI GERÇEKLEŞTİRİLEBİLEN MOLEKÜLLER

21 KAPİLER ELEKTROFOREZDE GÖÇ HIZLARI VE TABAKA YÜKSEKLİKLERİ
v= µe E eşitliğinde görüleceği gibi,bir iyonun göç hızı(v), elektrik alanın şiddetine bağlıdır.Elektrik alanı ise;uygulanan potansiyelin büyüklüğüne(V,volt) ve uygulandığı kapilerin uzunluğu L'ye bağlıdır. Bu eşitlik,istenilen hızlı iyonik göçü ve hızlı ayırmayı sağlamak için ,yüksek bir potansiyelin uygulanmasının gerekli olduğunu gösterir. Hızlı ayırma istenilmekle birlikte ,daha önemlisi daha yüksek bir ayırma gücü elde etmektedir. Uygulanan potansiyel (V) arttıkça iyonun göç hızı artar. Kapiler uzunluğu arttıkça göç hızı azalır.

22 KAPİLER ELEKTROFOREZDE TABAKA YÜKSEKLİKLERİ
D: cm2 s-1 cinsinden çözünen maddenin difüzyon katsayısıdır. Tabaka sayısının artmasıyla ayırma gücü arttığından,istenilen yüksek-ayırmalı ayırmaları başarmak için yüksek bir potansiyel uyugulanması gereklidir.Elektroforezde tabaka sayısı,kromatografinin aksine kolonun uzunluğu ile artmamaktadır. Kapiler elektroforez normalde; ile aralığında tabaka sayısına sahipken ,HPLC'de ise bu sayı 5000 ile arasındadır.Amino asit için kapiler zon elektroforez yöntemi ile tabaka sayısına ulaşılırken,polinükleotidlerin kapiler jel elektroforez yöntemi için tabaka sayısına ulaşıldığı literatürlerde yer almaktadır.

23 ELEKTROOSMOTİK AKIŞ Elektriksel olarak oluşturulan çözelti akışıdır.
Erimiş silika kapilerin iç duvarları silanol (Si-OH) grupları içerir.Bu gruplar yüksek pH’lı bir elektrolit çözeltisi ile temas ettiğinde iyonize olur. Erimiş silikanın iç yüzeyi Silanol gruplarının dissosiasyonu

24 Bu dissosiasyon kapileri eksi yüklü hale getirir.
Dissosiasyon sonucu eksi yük kazanmış kapiler iç yüzeyi. Elektronötraliteyi korumak için bu eksi yük üzerine çözeltideki katyonlar çekilerek çift tabaka oluşur Kapiler iç yüzeyinde çift tabaka oluşumu.

25 Bir gerilim uygulandığında bu katyonlar ve onların etrafında yani solvatize durumdaki su veya çözücü molekülleri katoda doğru hareketlenir. İyonların ve onların beraberindeki su moleküllerinin bu hareketi elektroosmotik akış adını alır Bu akış tüm çözünenenleri genellikle dedektöre doğru kapiler boyunca etkin bir şekilde pompalar. Kapiler elektroforez ayırma sisteminde elektroosmotik akışın gösterilişi.

26 EOA’ın kapiller duvarnda gerçekleştiğini gösteren şema

27 Elektroosmotik hareketlilik
eo =   / 4   r veo = eo V/L veo = Elektroosmotik akış hızı V = Uygulanan voltaj L = Kapilerin uzunluğu

28 Zeta potansiyeli, kapiler duvarındaki asidik silanol gruplarının iyonizasyonu ile belirlenir.
EOF elektrolit pH’ına büyük ölçüde bağlıdır. pH 4’ün altında iyonizasyon çok küçüktür. Bu durumda EOF hızı önemsizdir. pH 9’un üzerinde silanol grupları tamamen iyonlaştığı için elektroosmotik akış kuvvetlidir. Artan elektrolit derişimi zeta potansiyelini düşürdüğünden EOF hızını azaltır.

29 EOF kapiler boyunca her noktada sabit akış hızı üretir.
Bunun anlamı elektroosmotik akışın düz kesitli bir akış oluşturmasıdır. Elektroosmotik akış kesiti Bu akış profili, HPLC gibi çözücünün pompalandığı sistemlerde karşılaşılan, sürtünmeden dolayı kolonun kenarlarında daha yavaş, orta kısmında ise daha hızlı bir kesit oluşturan laminar akışa göre bir avantajdır.

30 Hidrodinamik akış kesiti
Laminar akıştaki homojen olmayan hız dağılımı pik genişlemesine sebep olur. Kapiler elektroforezde bileşenlerin ayrılması her bir türün elektroforetik hareketlilikleri ile elektroosmotik hareketliliğin toplamına göre oluşur. v = (e + eo) V/L e = Elektroforetik hareketlilik (Her bir iyonun karşıt yüklü elektroda doğru hareketi) V = Uygulanan gerilim

31 ++ 1 2 + 3 4 5 6 _ 7 8 = 9 10 Yük Molekül Cinsi
Göreceli göç etme sırası ++ Küçük çift yüklü 1 Büyük çift yüklü 2 + Küçük tek yüklü 3 Büyük tek yüklü 4 Küçük nötral 5 Büyük nötral 6 _ 7 8 = 9 10

32 Ayrıma Etki Eden Faktörler
Tampon Çözelti Seçimi Tampon çözeltinin cinsi ayrılacak iyona ve matriks iyonlarına bağlı olarak değişmektedir.Uygun tampon çözelti kullanılmadığında girşimler artmakta ve istenilen elde edilmemekte veya pik genişlemesi gözlenmektedir.

33 Tampon çözelti derişimi
Tampon konsantrasyonu arttıkça;sabit faz ile etkileşime giren iyonların elektroforetik mobilitelerinde azalma meydana gelmekte,bu yüzden kapilerde kalma süresi artmaktadır.

34 pH Etkisi pH arttıkça iyonizasyonla birlikte analit-sabit faz etkileşimleri artacağından alıkonma zamanları da artacaktır.

35 Sıcaklık Etkisi Sıcaklık arttıkça viskosite azalır.Dolayısıyla ; eo =   / 4   r formülü gereği eo artacağından alıkonma zamanın azalır.

36 Uygulama Voltajının Etkisi:
Uygulama voltajı arttıkça; veo = eo V/L formülü gereğince ,elektroosmotik akış hızı artacağından; alıkonma zamanı azalmaktadır. Viskosite Etkisi: Viskosite arttıkça;eo =   / 4   r formülü gereği eo azalacağından ilgili alıkonma zamanı da artacaktır.

37 ELEKTROFORETİK AYIRMA

38 KAPİLER ELEKTROFOREZDE PİK BANT GENİŞLEMESİ
Klasik elektroforezde hızlı ayırma sağlamak için yüksek gerilim uygulanması bant genişlemesine yol açar. CE’de kapiler yüzeyinden ısının kolay uzaklaştırılabilmesi nedeniyle pik genişlemesi gözlenmez. HPLC’de laminar akış bant genişlemesine neden olur. CE’de düz kesitli elektroosmotik akış etkin olduğu için pik genişlemesi gözlenmez. HPLC’de pikler ayrılma sonrası kolon ucundan dedektöre aktarılırken karışma sonucu pik genişlemesi olabilir. CE’de dedeksiyon kapiler üzerinde gerçekleştiği için pik genişlemesi sorunu olmaz. CE’de moleküler difüzyon ve örnek enjeksiyonu yönteminden ileri gelen pik genişlemeleri olabilir.

39 KAPİLER ELEKTROFOREZ İÇİN CİHAZ
µm iç çap ve cm uzunluğunda,tamponla doldurulmuş erimiş silika kapiler ,içinde platin elektrotlar bulunan iki tampon haznesi arasına yerleştirilmiştir.Numune bir uçtan verilirken ayrılan maddeler diğer uçta tayin edilir.Yüksek potansiyelli güç kaynağının kutubu gösterildiği gibi olabilir veya anyonların hızlı ayrılmasını sağlamak için ters çevrilebilir.

40 ALET BÖLÜMLERİ KAPİLER
Dışı poliimit koruyucu kılıf ile kaplanmış erimiş silika kapilerler kullanılır. 25-75μm iç çapında, cm boyunda olanlar en sık kullanıllanlardır. Kapilerin iç yüzeyi, kapiler duvarında farklı maddelerle kovalent bağlanmak suretiyle kimyasal olarak değiştirilebilir. Kararlı ve iyi ayırmalar yapabilmek için kapiler çevresinin sıcaklığını düzenlemek önemlidir.

41 Tamponlar Sitrat, borat, asetat, fosfat ve TRIS tamponları sık kullanılan tamponlardır. KAPİLERİN YIKANMASI Fused silika kapiler için: *1 N NaOH *0.1 N NaOH *Distile su *Çalışma elektroliti Organik çözücü ve kuvvetli asit Voltaj: 10-30kV

42 NUMUNE VERME En yaygın numune verme yöntemleri,elektrokinetik enjeksiyon ve basınç enjeksiyonudur.

43 Kapiler elektroforezde kullanılan dedektörler
HPLC'de kullanılan tüm dedektörler burada da kullanılabilir. Kapiler elektroforezde kullanılan dedektörler Tayin Yöntemi Gözlenebilme sınırı (belirlenen mol) Spektrofotometrik Absorpsiyon 10-15 – 10-13 Floresans : Kolondan önce türevlendirme Kolonda türevlendirme Kolondan sonra türevlendirme 10-17 – 10-20 8 x 10-16 2 x 10-17 Dolaylı Floresans 5 x 10-17 Termal Mercekler 4 x 10-17 Raman 2 x 10-15 Kütle Spektrometrik 1 x 10-17 Elektrokimyasal İletkenlik 1 x 10-16 Potansiyometri Verilmemiştir. Amperometri 7 x 10-19 Radyometrik 1 x 10-19 Bir UV dedektörü

44 Absorbans dedektörleri
Absorbans ölçümlerinin duyarlılığını arttırmak için,ölçüm yapılan ışın yolunun arttırılması gibi bazı teknikler ileri sürülmüştür

45 Direk UV dedeksiyonu İndirekt UV dedeksiyonu FLORESANS İLE TAYİN:.Yoğun ışın kaynağından faydalanarak gözlenebilme sınırlarını düşürmek amacıyla,küçük kapilerde uyarıcı ışını odaklamak için lazerli cihazlar tercih edilmektedir.Lazerli floresans tayin yöntemi kullanılarak,10 zeptamol veya 6000 molekül tayin edilebilmiştir.

46 Kütle Spektrofotometresinin dedektör olarak kullanımı

47 -FLORESANS İLE TAYİN: Floresans yapan analitlerin veya türevlerinin duyarlılık ve seçiciliğinin artmasına yol açar.Yoğun ışın kaynağından faydalanarak gözlenebilme sınırlarını düşürmek amacıyla,küçük kapilerde uyarıcı ışını odaklamak için lazerli cihazlar tercih edilmektedir. -ELEKROKİMYASAL TAYİN: İki çeşit elektrokimyasal dedektör kullanılmaktadır:iletkenlik ve amperometri. Elektrokimasal dedektörler ilgili problemlerden biri ayırmada kullanılan yüksek potansiyelden dedektör elektrotların izole edilmesidir.İzolasyon için kullanılan yöntemlerden biri,dedektör kısmının bulunduğu kapiler ile diğer kapiler arasına gözenekli cam veya grafit gibi gözenekli bağlantının eklenmesidir.

48 KAPİLER ELEKTROFOREZİN UYGULAMALARI
KAPİLER ZONE ELEKTROFOREZ Ayırma çözünendeki asidik grupların pH kontrollü dissosiasyonuna veya çözünendeki bazik grupların pH kontrollü protonlanmasına dayanır. İyonik türler yük/büyüklük oranlarındaki farklılıklara dayanarak ayrılır. Nötral bileşenler ayrılmadan dedektöre birlikte sürüklenir.

49 Uygulanan potansiyel ile karışımı oluşturan parçacıklar kendi iyonik hareketliliklerine göre zonlara ayrılırlar Çözünenin tüm kapiler boyunca göç etmesi için gereken zaman (t), kapiler uzunluğu (L) ile elektroosmotik ve elektroforetik hızların her ikisine bağlıdır. Ayırma hızını artırmak için kapiler boyunca yüksek gerilim uygulamak gerekir. Yüksek sıcaklıklarda tampon çözelti daha az viskozdur ve örnek iyonları elektroda doğru hareket ederken daha az dirençle karşılaştıklarından daha hızlı göç ederler.

50 Türlerin hareketliliği iyonu kompleksleştirmek suretiyle de değiştirilebilir.
Elektroosmotik akış varlığı katyonların ve anyonların tek bir analizle ayrılmasını ve tanınmasını sağlar. Bir çözünenin tüm göç etme zamanı çözünenin hareketliliği ve elektroosmotik akışın her ikisi ile de ilgilidir. Görünen hareketlilik elektroforetik ile elektroosmotik hareketliliklerin toplamına eşittir. t = L / (ve + veo)

51 KAPİLER JEL ELEKTROFOREZ
Çeşitli boyutlardaki çözünenler jelle dolu kapiler boyunca dedektöre göç ederken bir eleme etkisi meydana gelir. Küçük iyonlar jel boyunca daha hızlı hareket edebilir. Kapiler jel elektroforez Daha büyük iyonlar jel matriksinde engellenerek göç hızları düşürülür. Yaklaşık olarak aynı yüke sahip olan fakat büyüklükleri (hacimce) farklı olan proteinler ,DNA parçaları ve oligomerler gibi makromoleküllerin ayrılmasında önemli ölçüde faydalanılır. Elektroforezde en çok kullanılan jel tipi olarak çapraz bağlayıcı reaktiflerin bulunduğu ortamda akrilamidin ( CH2 = CH - CO -NH2 ) polimerleşmesiyle meydana gelmiş poliakrilamid polimeri kullanılmaktadır

52 Polimerin gözenek boyutu,monomer ile çapraz bağlayıcı reaktifi arasındaki orana bağlıdır.
Çapraz bağlayıcı reaktifin miktarının artması,polimerde gözenek boyutunu küçültür.Kapiler elektroforezde kullanılan diğer jel türleri agaroz( deniz alglerinden elde edilen bir tür polisakkarit ) ;metil selüloz ve polietilen glikoldür

53 KAPİLER İZOTAKOFOREZ Örnek, iki farklı tampon çözelti arasına enjekte edilir Voltaj uygulaması ile analitlerin hareketliliklerine uygun olan sisteme doğru hareket etmesi sonucu ayırım sağlanır. Analiz sonunda izotakoferogram adı verilen ve analit bölgelerinin ilerleme aşamasını gösteren bir grafik elde edilir. Bu tekniğin kullanıldığı herhangi özel bir uygulamada ya anyonlar ya da katyonlar ayrılabilir,fakat her ikisi aynı anda yapılamaz. Numunedeki en hızlı iyon ilk tamponun hemen ardında ve yavaş iyonda sonraki tamponun hemen önünde yer alır.

54 Bantlar oluştuktan sonra hepsi de aynı hızda hareket eder
Bantlar oluştuktan sonra hepsi de aynı hızda hareket eder.Bantların aynı hızda hareket etmeleri sebebi,potansiyelin daha hızlı hareket eden bantlar için azalırken ,daha yavaş bantlar için artmasıdır.Böylece tamponlardan geçen akım aynıdır. İzotakoforetik bir deneyde dengeye ulaşıldığında,öyle bir duruma ulaşılır ki şekilde görüldüğü gibi numunedeki herbir iyon bandı ,kendine bitişik daha yavaş hareket eden iyon ile daha hızlı hareket eden iyon bandı arasında kalacak şekilde hareket eder.Bantlar arasındaki sınırlar oldukça kesindir.Eğer çözünmüş tanecikler daha hızlı banda difüzlenecek olursa,daha düşük elektrik alanla karşılaşır ve sonuçta onun kendi orjinal bandına gelinceye kadar hızının düşmesine sebep olur.

55 KAPİLER İZOELEKTRİK ODAKLAMA
Pozitif ve negatif yüklü grupları aynı anda bulunduran amfoterik türlerin ayrılmasında kullanılır . Proteinler ve amfoterik türler, pozitif yüklerinin sayısının negatif yüklerinin sayısına eşit olduğu bir pH değerine yani pI (izoelektrik nokta) değerine sahiptirler.

56 Örnek kapilerin düşük pH’lı ucundan enjekte edilir
Örnek kapilerin düşük pH’lı ucundan enjekte edilir. Bu durumda pozitif yüklü olduğu için kapiler boyunca dedektöre doğru göç eder. Çözünen, pH gradienti içinde kendi pI noktasına geldiğinde yüksüzleşir ve durur. Karışımdaki farklı çözünenler farklı pI değerlerine sahip olduğu için gradient boyunca farklı bölgelerde durur. Tüm bölgelerin odaklanması tamamlandığında voltaj uygulanmaya devam ederken kapilere basınç uygulanır. Basınç, pH gradientini kapilerde dedektöre sürükler ve bu ayrılmış bölgeler dedektör penceresinden geçerken saptanmış olur.

57 KAPİLER ELEKTROKROMATOGRAFİ(CEC)
Sıvı kromatografisi (LC) ve CE’in bileşimi bir tekniktir. LC’de kullanılan sabit faz yerine farklı kromatografik malzemeler kullanılarak modifiye edilmiş kapiler kolonlar kullanılır. Ayırım mekanizması, sabit faz ile hareketli faz arasındaki dağılıma dayanır. CEC’de akış, voltaj uygulaması sonucu oluşan elektroosmotik akış ile sağlanır.

58 DOLGULU KOLON ELEKTROKROMATOGRAFİ:
Elektrokromatografi,kapiler elektroforez ve HPLC'nin iyi özelliklerini birleştiren hibrit bir yöntemdir. İki türü vardır: Dolgulu kolon ve Micellar Elektrokinetik kapiler. DOLGULU KOLON ELEKTROKROMATOGRAFİ: Polar bir çözücü elektroosmotik basınç ile ters-faz HPLC dolgusu ile doldurulmuş kapilerden geçer.Ayırma ,numune bileşenlerinin durgun faz ile hareketli faz arasındaki dağılımına bağlıdır. Şekilde 16 adet poliaromatik hidrokarbonun 33 cm uzunluğunda ve 75 µm iç çaplı kolondan elde edilen elektrokromatogramı görülmektedir.Hareketli faz,4mM sodyum borat çözeltisindeki asetonitrilinden ,durgun faz ise 3 µm oktadesilsilikat parçacıklarından yapılmıştır.

59 Miseler Elektrokinetik Kapiler Kromatografi (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC)
Bu yöntem kapiler zone ile ayrılamayan yüksüz (nötral) bileşenlerin ayrılması için geliştirilmiştir Ayırmada oldukça yüksek derişimde sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi yüzey aktif madde içeren yüksek pH’ta bir elektrolit çözeltisi kullanılır. Her yüzey aktif madde için spesifik olan bir derişimin üzerinde yüzey aktif madde molekülleri kümeleşmeye başlar. Bu derişim kritik misel derişimi (critical micelle concentration, cmc) olarak adlandırılır. Bu derişimin üzerinde kümeleşen yüzey aktif maddeler hidrofobik kısmın polar olmayan bir çekirdek, hidrofilik grupların ise bir dış kabuk oluşturduğu miseller oluşturur.

60 SDS miselleri negatif yüklüdür.
Nötral bileşenlerin miseller tarafından taşınması SDS miselleri negatif yüklüdür. Negatif yüklü olduğu için de elektroosmotik akışa ters yönde hareket eder. Elektroosmotik akış SDS misellerini dedektöre sürükleyecek kadar güçlüdür Örnekteki türler, HPLC’de durağan fazda alıkonulmaya benzer şekilde miselin iç kısmında dağılıma uğrarlar. Sulu tamponlu mobil faz ve miseler yalancı durağan faz arasındaki dağılım farkı yüksüz moleküllerin ayrılmasının tek temelidir

61 Nötral bileşenlerin miseller tarafından taşınması

62 ELEKTROFOREZ UYGULAMALARININ KULLANILDIĞI ÇALIŞMA ÖRNEKLERİ

63 Amaç:Domuz eti örenkerinde fosfat(V) bileşiklerinin tayini.
ET ÖRNEKLERİNDEKİ FONKSİYONEL KATKI MADDELERİ İÇİN KAPİLER İZOTAKOFOREZ UYGULAMALARI Ayşen HÖL, Aneta JASTRZEBSKA, Edward SZLYK[23-27 Agustos 2007,21.Ulusal Kimya Kongresi,Malatya] Amaç:Domuz eti örenkerinde fosfat(V) bileşiklerinin tayini. İşlem:Elektrolit olarak 10 mM HCl ve β-alanin, ve elektrolit olarak 5 mM heksanoik asit ve glutamik asitin kullanıldığı iki ayrı kapiler izotakoforez yöntemi ile tayin edilmiştir.

64 TERPENOİD ve HİDROKSİ ANTROKİNON YAPISINDAKİ BİTKİ AKTİF MADDELERİNİN AYRIMI VE TAYİNİ İÇİN KAPİLER ELEKTROFOREZ İLE ANALİZ YÖNTEMLERİ GELİŞTİRİLMESİ VE BU YÖNTEMLERİN TÜRKİYE'DEKİ BİTKİ FLORASINDAKİ ÖRNEKLERİN ANALİZİNDE KULLANILMASI ADA ÇAYI ÖRNEKLERİNDEKİ KARSONİK VE ROSMARİNİK ASİT İÇERİKLERİNİ CE İLE ANALİZİ:

65 Elektroforez uygulamaları
Kapiler iç çapı 50 µm ,toplam uzunluğu 53 cm etkin uzunluğu 45 cm kapiler kullanılmıştır.Yıkama için 1M NaOH kullanımış,kullanım öncesi yarım saat,her enjeksiyon arasında 3 dakika ve 2 dakida daha da kullanılan tamponla yıkama gerçekleştirilmiştir.Ayırma voltajı 28 kV ve injeksiyon basıncı 0,005 MPa ,injeksiyon süresi 5 sn'dir.Tayinler 210 nm'de gerçekleştirilmiştir.

66 Elektroforez uygulamaları
Adaçayı ekstresinin elektroferogramı.Tampon 4mM borat, pH 9.6 ,uygulan voltaj 28 kV . Pikler:1-Kumarin (iç standart) 2-Karnosik asit 3-rosmarinik asit.

67 SALVIA CHINONANTHA VE SALVIA KRONENBURGI BİTKİLERİNDE HORMİNON VE 7-0-ASETİLHORMİNONUN BİRARADA TAYİNİ: Yapılar nötral olduğundan elektroforezle tayin edilemezler; ancak hidrofilik ve hidrofobik gruplar taşıdığından;bu iki madde aynı anda MEKC yöntemiyle tayin edilebilmektedir. 75 µm iç çapında ,toplam kapile uzunluğu 68 cm , injeksiyon ve dedeksiyon noktası arasındaki fark 60 cm alınarak gerçekleştirilmiştir. Kapiler kullanımdan önce yarım saat 1M NaOH ,su ile 10 dakika ve kullanılan tampon çözelti ile 10 dakika yıkanmıştır.

68 Elektroforez uygulamaları
İnjeksiyon aralarında 0.1 mol/L NaOH çözeltisiyle 3 dakika,tampon çözeltisiyle 2 dakika yıkanmıştır.Ayırma voltajı 28 kVdir.Dalga boyu 230 nm'ye ayarlanmıştır.Ayırma elektroliti pH 11.5 'e ayarlanan 50mM SDS ve %25 metanol olarak belirlenmiştir. Miktar tayini için 7-O-asetil horminon için 10,20,30,40,50,100 µg/ml konsantrasyonu arasında hazırlanan standart çözeltilerin pik alanları ile konsantrasyonları arasında kalibrasyon eğrisi çizilmiştir.Saflaştırılarak ede edilen horminonun pik yeri saptanmış ,horminon miktarı yapı benzerliği nedeniyle eşdeğer düzeltme yapılarak 7-O-asetil horminonun kalibrasyon grafiğinden saptanmıştır.Sonuçta köklerdeki horminon miktarı 77,13 µg/g ve 7-Oasetil horminon miktarı 58,03 µg/g olarak bulunmuştur.

69 Elektroforez uygulamaları
Salvia Chionantha kök ekstresi elektroferogramı.Pikler:1-Horminon 2- 7-O-asetil horminon

70 İnorganik anyonların ve organik asitlerin meyve sularında ve sarapta tayini
Nevin OZTEKIN, F. Bedia ERIM,Technical University of Istanbul, Department of Chemistry Bu çalışmada 12 adet inorganik anyon ve organik asit karısımının aynı anda tayini gerçeklestirilmiştir. PEI kaplı kapilerler kullanılarak polarite tersine çevrilmiştir. Ancak ayrılan iyonlar UV aktif olmadıklarından dolaylı deteksiyon tekniği uygulanmış tampon olarak seçilen 2,6-piridindikarboksilik asit kromofor özelligi nedeniyle dolaylı dedeksiyonu mümkün kılmıştır. Bu yöntemle klorür, sülfat, okzalat, tartarat, malat, süksinat, iyodat, sitrat, asetat, laktat, fosfat, propiyonat anyonları bir arada ayrılmıştır. Yöntem çesitli meyve suları ve beyaz sarap içinde anyonların tespitine uygulanmıştır.

71 Electropherogram of a standard mixture of four inorganic anions and eight organic acids. Peaks: 1=chloride, 2 = sulfate, 3 = oxalate, 4 = tartarate, 5 = malate, 6 = succinate, 7 = iodate, 8 = citrate, 9 = acetate,10 = lactate, 11 = phosphate, 12 = propionate. Background electrolyte: 3mM PDC at pH 5.5. Injection 4 x 10-4 MPa, 6s. Concentrations of ions are 0.2 mM for chloride, sulfate, oxalate, iodate, and citrate, 0.1mM for others.

72 Meyve Suları içinde Karbohidrat Analizi
Gürel A, Hızal J, Öztekin N, and Erim F.B Separation of carbohydrates by capillary electrophoresis using a dipeptide as separation electrolyte Bu çalısmada insan metabolizmasında proteinlerle karbonhidratların iliskisine dayanarak, CE de ayırma ortamı olarak 8 adet amino asit, 16 adet mono ve disakkaridin ayrılması için ayırma ortamı olarak denenmistir. Ayrılan sakkaridler, glukoz, fruktoz, sukroz, fukoz, ksiloz, ramnoz, riboz, mannitol, ksitol, laktoz, arabinoz, liksoz, sellibioz, maltoz, mannoz, ve galaktoztur. Glisil-glisin 16 adet karbonhidratın ayrılması için en uygun ayırma ortamı olarak tespit edilmistir. Yöntem meyve sularında sukroz, glukoz ve fruktoz tayinine uygulanmıstır.

73

74 HLA DQA1'in PRC ÜRÜNLERİNİN KAPİLER JEL ELEKTROFOREZİ
Sevgi YILMAZ,Salih CENGİZ[Cerrah Paşa Tıp Dergisi,1999,30(3): ] HLA DQA1 lokusu Adli bilimler araştırmaları için hızlı, kolay, güvenilir bilgi alınabilen polimorfik DNA lokusudur. Bu çalışmada, kapiller jel elektroforez (CGE)'nin az miktarda örneğe gereksinim duyması, hızlı ve çabuk ayırım süresi, yüksek ayırıcılığı, kolay miktar hesabı ile otomasyona uygunluğu gibi özelliklerinden yola çıkılarak HLA DQA1 in PCR ürünlerinin ayırımı amaçlanmıştır. Kapiler Jel Elektroforezinin Uygulanması:İç çapı 75 µm., uzunluğu 45 cm olan silika kapiller kolon alınmıştır. Dedeksiyon için gerekli olan optik pencere, kapilleri kaplayan polimer tabakanın (kapiller kasetin mercek bölümüne yakın tarafından 8-9 cm arası) 0.5 cm kadar alevle yakılmasıyla açılış ve alkolle temizlenmiştir.

75 Elektroforez uygulamaları
Her deneyden önce yeni ve kaplı olmayan kapiller, 1 saat 1 M NaOH, 30 dakika 0.1 M NaOH ile muamele edilmiştir. Kapiller kolondan 5 dakika, 80µL MAPS (g-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ve 20 mL distile su karışımı (asetik asit ile pH:3.5'e ayarlanarak) geçirilmiştir. MAPS çözeltisi 1 saat oda ısısında kapiller kolonda bırakılmış ve kapiller kolon 5 dakika distile su ile yıkanmıştır.%4 (w/v)'lük akrilamid çözeltisine polimerizasyonu sağlamak için mililitre başına 1 µL. TEMED ve 1 mg. Potasyumpersülfat eklenerek 30 dakika boyunca kapiller kolondan geçirilmiştir.. 5 dakika distile suyla yıkanarak kapiller duvarına yapışmayan akrilamid artıkları dışarı atılmıltır. Kapiller kolon, 35 °C'de 1 saat kurutulmuştur.Dökme jel elektroforezinde tiplenen PCR ürünleri, otoklavlanmış pipet uçlarıyla ve yine otoklavlanmış mikrovial (500 µL hacimli şişe)'le konularak enjeksiyon gerçekleştirildi. Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra mikrovial içindeki PCR ürünleri -20°C'de saklanmıştır. Her enjeksiyondan önce ve sonra kapiller, çalışma tamponu ile 3 dakika yıkanmıştır. Çalışmamızda kullanılan TBE Çözeltisi 89 mM Tris Base, 89 mM Borik asit, 5 mM EDTA, %0.25 HPC (Hidroksipropil sellüloz) dan oluşacak şekilde hazırlanarak , NaOH ile pH: 8.13 e ayarlandı. Otoklavlanarak buzdolabında saklanmıştır

76 Elektroforez uygulamaları
Kapiler Jel Kromatografi Koşullar: Kapiller Tipi: Poliakrilamid ile kaplı kapiller; Enjeksiyon Tipi: Elektrokinetik; Enjeksiyon Zamanı: 8s; Voltaj: -28 kV; Enjeksiyon Voltajı: 10 kV; Akım: 90 µA; Standart Sıcaklık: 30°C; pH: 8.13; % HPC: 0.25 Sonuç: Kapiller JeL elektroforezinde dakikalar arasında 2 pik görülmüştür.Bu iki pikin gerçekten HLA DQA1 lokusu olup olmadığı doğrulanmıştır.

77 Hemoglomin Elektroforezi
Rutin analizlerde selluloz asetat membranı,agaroz jel kullanılarak pH 8.5 de uygulanan Hb elektroforezi, oldukca kolay, duyarlı ve hızlı bir yöntemdir.Alkali pH' da, hemoglobin molekülü negatif yüklüdür ve elektriksel ortamda anoda(+) doğru göç eder. Hb'ler molekul başına düşen yük nedeniyle, Hb A’ya gore Hb S 2x, Hb C 4x daha fazla yük taşır. Böylece anoda doğru Hb S ve Hb C, Hb A'dan cok daha yavaş hareket eder.

78 Elde edilen elektroferogramlardan yola çıkarak anemi, talesemi gibi hastalıkların tehşisi konmaktadır.Bu sistemler günümüzde otomasyonu yapılmış,basit bir şekilde uygulanmaktadır.

79

80

81 İdrar Elektroforezi Elektroforez icin en az 10 ml idrara ihtiyac vardır. Bu minimum miktardan, optimal konsantrasyon elde etmek icin,idrar orneği konsantre edilir.İdrar protein elektroforezi proteinurinin değerlendirilmesinde kullanılır.Multiple myeloma suphesi olan hastalarda, Bence Jones proteinlerinin tesbit edilmesi icin tercih edilen bir metotdur. İdrar elektroforezi, daima serumla birlikte yapılır, boylece sonuclar direkt olarak karşılaştırılabilir.

82 Kaynaklar -Douglas A.Skoog,F.James Holler,Timothy A.Nieman,ENSTRÜMANTAL ANALİZ,Bilim Yayıncılık,Fifth Edition. -Leman YALÇINTEPE GÜNEŞTUTAR*, Macide CANTÜRK RODOP,NEW APPROACHES IN ELECTROPHORESIS,Review Paper,Sigma Journal of Engineering and Natural Sciences Mühendislik ve Fen Bilimleri Dergisi,27, ,2009. -Vildan Fidancı,ELEKTROFOREZ UYGULAMALARI VE KLİNİK LABORATUVAR,2010. -Uzm. Ecz. Emirhan NEMUTLU,KAPİLER ELEKTOROFOREZ NOTLARI. -Yrd.Doç.Dr. Seda ÜNSALAN,KAPİLLER ELEKTROFOREZ ,FarmasötikKimya Anabilim DalıÖğretim Üyesi, -Ayşen HÖL, Aneta JASTRZEBSKA, Edward SZLYK,ET ÖRNEKLERİNDEKİ FONKSİYONEL KATKI MADDELERİ İÇİN KAPİLER İZOTAKOFOREZ UYGULAMALARI ,21.Ulusal Kimya Kongresi,Malatya,23-27 Agustos

83 -Leman Damla KOTAN ,SİLİKA METODU İLE KEMİKTEN DNA EKSTRAKSİYONU , YÜKSEK LİSANS TEZİ,Çukurova Üniversitesi,Sağlık Bilimleri Enstitüsü,Adli Tıp Anabilim Dalı,Adana Temel Bilimler Araştırma Grubu,TERPENOİD ve HİDROKSİ ANTROKİNON YAPISINDAKİ BİTKİ AKTİF MADDELERİNİN AYRIMI VE TAYİNİ İÇİN KAPİLER ELEKTROFOREZ İLE ANALİZ YÖNTEMLERİ GELİŞTİRİLMESİ VE BU YÖNTEMLERİN TÜRKİYE'DEKİ BİTKİ FLORASINDAKİ ÖRNEKLERİN ANALİZNDE KULLANILMAS,TÜBİTAK PROJESİ-PROJE NO:TBAG T053,İSTANBUL,Ekim Sevgi YILMAZ,Salih CENGİZ,HLA DQA1'in PRC ÜRÜNLERİNİN KAPİLER JEL ELEKTROFOREZİ,Cerrah Paşa Tıp Dergisi,1999,30(3): Nevin OZTEKIN, F. Bedia ERIM,Simultaneous Determination of Inorganic Anions and Organic Acids by Capillary Electrophoresis,Technical University of Istanbul, Department of Chemistry. -Erim F.B., Xu X and Kraak J.C Application of micellar electrokinetic chromatography and indirect UV detection for analysis of fatty acids, J. Chromatogr. A 694: Gürel A, Hızal J, Öztekin N, and Erim F.B Separation of carbohydrates by capillary electrophoresis using a dipeptide as separation electrolyte.