Moleküler Floresans Spektroskopi

... konulu sunumlar: "Moleküler Floresans Spektroskopi"— Sunum transkripti:

1 Moleküler Floresans Spektroskopi

2 *Biyolüminesans: Canlı organizmalarda biyokimyasal reaksiyon sonucu
*Kemilüminesans: Kimyasal reaksiyon sonucu -Elektrokemilüminesans: Elektrokimyasal olaylar *Fotolüminesans: Işık ile uyarım -Floresans -Fosforesans *Kristalolüminesans: Kristalizasyon sürecinde *Elektrokemilüminesans: Elektrik akımı geçişi -Katadolüminesans: İndirgenme olayları *Mekanolüminesans: Mekanik etki -Tribololüminesans: Sürtünme ve ezilme sırasında bağ kırınımı -Fraktolüminesans: Kristallerin kırılması -Piezolüminesans: Basınç uygulanması -Radyolüminesans: İyonize radyasyon bombardımanı -Sonolüminesans: Ses ile uyarım -Termolüminesans: Isı ile uyarım

3 Moleküler Lüminesans Spektrometri
Lüminesans çeşitleri: i. floresans ii. fosforesans iii. kemilüminesans iv. biyolüminesans

4 Floresans ve Fosforesansın Teorisi:
Absorpsiyon s s floresans s fosforesans e- hn1 absorplayarak uyarılır e- temel hale dönerken hn2 emisyon yapar hn2 kalitatif ve kantitatif analizler için kullanılır

5 Floresans – singlet hal - temel hale dönüş
Fosforesans – triplet- temel hale dönüş Floresans Fosforesans s s E Eşleşmemiş spinler Net manyetik alan Eşleşmiş spinler Net manyetik alan yok Moleküllerin elektron spin halleri. (a) Temel elektronik hal. En düşük enerjili veya temel halde, spinler daima eşleşmiştir ve bu hale temel singlet hal denir. (b) ve (c) Uyarılmış elektronik hallerdir.Uyarılmış halde spin eşleşmiş halde kalırsa, molekül uyarılmış singlet haldedir (b). Spin eşleşmemiş halde kaldığında ise, molekül uyarılmış triplet haldedir (c).

6 Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji

7 Gecikmiş Floresans Işımasız geçişler -IC 10-11-10-9 s
-ISC s Fosforesans s Floresans s Absorbsiyon s Sm Tm S1 T1 S0 Temel hal

8 Molekülün düşük enerji seviyesine veya temel hale dönüşünde titreşim, diğer moleküllerle çarpışma vb. nedenlerle ışımasız geçişler olur. Bu da molekülün absorpladığı enerjiden daha az emisyon yapmasıyla sonuçlanır.

9 Deaktivasyon Uyarılmış molekülün temel hale dönme işlemi Işımasız Deaktivasyon Fotonun emisyonsuz, ışımasız temel hale dönüşü

10 Terim: Absorpsiyon Etki: Uyarma
Sm Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Terim: Absorpsiyon Etki: Uyarma İşlem: Analit molekülü fotonu absorplar (çok hızlı ~ – s); elektron üst enerji seviyesine çıkar. Farklı l’ları  farklı titreşim enerji seviyelerine çıkış S1 S0

11 Terim: Titreşimsel durulma
Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Sm S1 S0 Terim: Titreşimsel durulma (vibratinal relaxation) Etki: Işımasız deaktivasyon İşlem: uyarılmış analit moleküllerinin diğer moleküllerle çarpışması  fazla titreşim enerjisini kaybetmesi daha düşük titreşim seviyelerine geçiş

12 (internal convertion) Etki: Işımasız deaktivasyon
Sm Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji S1 S0 Terim: İç dönüşüm (internal convertion) Etki: Işımasız deaktivasyon İşlem: Molekül daha düşük enerji seviyesine geçer– iki elektronik halin titreşim enerji seviyeleri çakışır ve molekül diğer elektronik seviyeye geçer

13 (external conversion):
Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Terim: Dış dönüşüm (external conversion): Etki: Işımasız deaktivasyon İşlem: Uyarılmış haldeki analit moleküllerinin diğer moleküllerle çarpışması molekül temel hale foton emisyonu yapmadan döner.

14 Etki: Deaktivasyon, hn emisyonu
Sm Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji S1 S0 Terim: Floresans Etki: Deaktivasyon, hn emisyonu İşlem: fotonun singlet hale geçişi sırasındaki emisyon (kısa – uyarılmış hal ömrü~10-7 – 10-9 s).

15 Terim: Sistemler arası geçiş (intersystem crossing):
Etki: Işımasız deaktivasyon İşlem: Singlet halden triplet hale geçerken elektronun spin değiştirmesi. İki halin titreşim seviyeleri çakışırsa meydana gelir. Ağır atoma sahip moleküllerde gözlenir. (ör., I veya Br) Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji

16 Etki: Deaktivasyon, h‘de emisyon
Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji T1 S0 Terim: Fosforesans Etki: Deaktivasyon, h‘de emisyon İşlem: Fotonun tripletten singlete dönerken yaptığı emisyon (uzun–uyarma hal ömrü~ 10-4 – 101s)

17 Kinin çözeltisinin uyarma ve emisyon spektrumu
STOKES SHIFT l1 l3 l2 Uyarma Emisyon Dalgaboyu, nm Bağıl şiddet Kinin çözeltisinin uyarma ve emisyon spektrumu Stokes kayması

18 Jablonski Enerji Diagramı
S2, S1 = Singlet Haller T1 = Triplet Hal Rezonans ışıma - molekülün absorpladığı l’da emisyon yapması (emisyon = uyarma) Stokes kayması- molekülün absorpladığı l’dan yüksek l’da (düşük enerji) emisyon yapması ( emisyon >  uyarma)

19 Stokes kayması Uyarma Dalgaboyu, nm Bağıl şiddet Uyarma Emisyon
Emisyon Dalgaboyu, nm

20 Fosforesans: daha uzun dalgaboyu
Fenantren’in uyarma, floresans ve fosforesans spektrumları

21 Floresansı etkileyen faktörler
Kuantum Verimi (f): kuantum verimi = luminesans yapan moleküllerin sayısının uyarılmış molekül sayısına oranı lüminesans yapan moleküller f = uyarılmış moleküller

22 Floresans Kuantum Verimi
kec = dış dönüşüm (external conversion) (S1  S0) kic = iç dönüşüm (internal conversion) (S1  S0) kisc = sistemler arası geçiş (intersystem crossing) (S1  T1) kpd = predissociation kd = dissociation

23 Floresans ve Yapı Düşük enerji   * geçişi (aromatik): oldukça güçlü floresans 250 nm nin altında=> 140 kJ/mol birçok bağ kırılır - floresans gözlenmez s*  s - floresans gözlenir p*  p veya p*  n Konjuge çift bağ yapısı floresansı arttırır. Halka sayısının artmasıyla floresans artar. Yapının sağlamlığı (ör., naphthalen veya florene, bifenil) floresansı arttırır. Esneklik azaldığı için floresans artar. Sıcaklığın azalması moleküller arası çarpışmayı azaltacağından dış dönüşüm ve diğer ışımasız geçiş ihtimalleri azalır ve floresans artar. Floresans metale bağlı şelat ajanları olduğunda artar.

24 Floresans özelliği göstermeyen aromatik moleküller.
Floresans özelliği gösteren tipik aromatik moleküller.

25

26 Çözücü etkisi: Viskosite arttıkça floresans artar (dış dönüşüm ile ışımasız deaktivasyon azalacağı için) Ağır metal etkisi: I, Br, Th gibi ağır atomlar: sistemler arası geçiş artar, fosforesans artar.

27 pH etkisi: Rezonans yapılar artacağından kararlı uyarılmış hal ve kuantum veriminde artış
pH emisyon l’nu da etkiler (asit ayrışma sabitindeki değişim yüzünden) Anilinin rezonans formları Anilinyum iyonu

28 Çözünmüş O2 etkisi: - [O2] artışı florasans azalır - paramanyetik özellik sistemler arası geçişi (intersystem crossing) arttırır (spin flipping)

29 Işıkla parçalanma (Photobleaching): uyarılmış haldeki molekül diğer fotonu absorplar ve parçalanır  uyarılmış haldeki parçalanmış molekül floresans yapamaz

30 Floresans Şiddeti ve Analit Derişimi
F= 2.3K’ebcP0 F = Kc Floresans şiddeti derişimle doğrusal olarak değişir. Yüksek derişimlerde self absorpsiyon ve quenching nedeniyle doğrusallıktan sapma olur. Self absorpsiyon: Komşu molekül diğer molekülün yaptığı emisyonu absorplar – uyarma ve emisyon spektrumları çakışırsa gözlenir.(le = la) Quenching (sönme): Uyarılmış haldeki moleküllerin uyarılmış diğer moleküllerle çarpışması  ışımasız deaktivasyon

31 Derişimin Floresans ve Fosforesansa Etkisi
Düşük derişimde: F = 2.3K’ebcPo Yüksek derişimdeki sapma self-quenching veya self-absorption nedeniyledir. Derişim (µM) Floresans Şiddeti

32 Floresans Spektrofotometre
Tipik floresans cihazları. (a) Filtreli florometre. Floresans ışıması her yöne yayıldığı için, 90 derece tasarımı, dedektörün kaynağı görmesini engeller. (b) İki optik ağ monokromatörü ile donatılmış spektroflorometre. Burada da emisyon, 90 derece tasarımı ile ölçülür. İki monokromatör, uyarma spektrumunun (sabit bir emisyon dalga boyunda yayılan uyarma dalga boylarının spektrumu) taranmasını sağlar. Aynı tasarımla, emisyon spektrumu (sabit uyarma dalga boyunda yayılan dalga boylarının spektrumu) veya senkronize ışınlar spektrumu (iki monokromatörle, uyaran ve yayılan ışınlar arasında sabit bir dalga boyu farkı sağlanacak her iki spektrumun aynı anda kaydı) alınabilir.

33 Floresans Spektrofotometrelerin Bölümleri
Işık kaynakları Düşük basınçlı Hg lambaları 254, 302, 313, 546, 578, 691,773 nm çizgilerinde Yüksek basınçlı xenon ark lambaları (300 – 1300 nm) Lazerler Dalga boyu seçiciler Filtreler Monokromatörler Numune kapları Cam, kuartz hücreler Dedektörler - Fotoçoğaltıcı tüpler

34

35

36

37

38 Uyarma ve Emisyon Spektrumları
Uyarma spektrumu: Emisyon dalga boyu sabit tutulur, uyarma dalga boyu taranır. Monokromatör veya filtreler yalnızca floresans ışığın l’un geçmesine izin verecek şekilde seçilir Emisyon spektrumu: Uyarma dalga boyu sabit tutulup emisyon l taranır. Molokromatör veya filtreler yalnızca uyarma l’nun numuneden geçmesine izin verecek şekilde seçilir.

39 Bağıl şiddet Uyarma Emisyon Dalgaboyu, nm

40 Floresans Absorpsiyon
Duyarlılık ( ) Duyarlılık nano-femto molar ( M) mikro(10-6) M Dinamik aralık x Doğruluk, kesinlik Doğruluk, kesinlik (1-5 kat)

41 Singlet uyarılmış hal Triplet uyarılmış hal İç Dönüşüm Titreşimsel Durulma Sistemlerarası Geçiş Absorpsiyon Floresans Fosforesans ve Dış Dönüşüm Temel Hal Enerji Fosforesans Yöntemi Fosforesans moleküllerin triplet halden temel hale dönerken yapmış olduğu emisyonun ölçümüne dayanır s sürer. Ortamda I, Br gibi ağır iyonların olması fosforesansı arttırır.

42 Fosforesans yöntemleri
Düşük sıcaklıkta fosforesans Numune organik çözücü içinde homojen olarak karıştırılarak sıvı azot ortamında dondurulur. Numune hücresi 1-3 mm iç çaplıdır. Daha büyük olursa donma homojen olmaz.

43 2) Oda sıcaklığında fosforesans
a) Katı yüzeyden: Numune filtre kağıdı, polimer gibi katı yüzeye tutturulur. b)Çözelti ortamında Misel: Yüzey aktif maddenin içerisinde hapsedilir. Siklo dekstrin: Taç eterin kavitesine yerleşir. Ağır iyon etkili: Çözeltiye I, Br gibi ağır iyonlar eklenir.

44 MİSEL Hidrofilik Hidrofobik Hidrofilik uç Sulu çözelti Organik çözelti
Hidrofobik uç Sulu çözelti Organik çözelti

45

46 SİKLODEKSTRİN Hidrofobik iç yüzey İkincil yüzey Birincil yüzey

47 0.01M -CD (çizgi) ve 0.01 M -CD (noktalı çizgi) içerisinde5x10-5 M fenantrene ait emisyon spektrumu Dalga boyu (nm) Floresans Şiddeti

48 Kemilüminesans ve Biyolüminesans
Bir kimyasal reaksiyon, temel haline dönerken, ışık yayan veya enerjisini daha sonra emisyon yapacak başka türe aktaran elektronik olarak uyarılmış bir tür verdiğinde kemilüminesans meydana gelir. Kemilüminesans olayı biyolojik sistemlerde de gözlenir. Bu olaya biyolüminesans adı verilir. Ateş böceği, deniz anası

49 Luminol+ H2O2

50 A + B C* + D A + B C* + D C* X  X * C*C + hl X *  X + hl
Kemilüminesans Olayı Bir kimyasal reaksiyon, temel haline dönerken, ışık yayan veya enerjisini daha sonra emisyon yapacak başka bir türe aktaran, elektronik olarak uyarılmış bir tür verdiği zaman kemilüminesans meydana gelir. A + B C* + D C* X  X * X *  X + hl A + B C* + D C*C + hl

51 Kemilüminesant reaksiyonların temel özellikleri
Ekzotermik Enerjinin kanalize edileceği tek olasılıklı reaksiyon olmalı Oluşan uyarılmış durumdaki molekül fazla enerjisini foton olarak vermeli

52 Kemilüminesans ölçmeleri için cihaz, oldukça basittir ve sadece uygun bir reaksiyon kabı ve bir fotoçoğaltıcı tüpten oluşur; Genel olarak, tek ışın kaynağı, analit ile reaktif arasındaki kimyasal reaksiyon olduğundan, dalga boyu seçici cihazına gerek yoktur. Numune Kabı Dalgaboyu seçici Dedektör Sinyal işlemci Zamanın bir fonksiyonu olarak, bir kemilüminesans deneyinden elde edilen tipik sinyal, reaktif ve analitin karıştırılması tamamlandığında, hızla en yüksek değere ulaşır

53 *Kemilüminesans oluşturan kimyasal reaksiyonlar azdır bu yüzden işlem bağıl olarak az sayıdaki tür ile sınırlıdır. Ancak, kemilüminesans vermek üzere reaksiyona giren bileşiklerin bazıları önemli bileşikleridir. Bu nedenle, yüksek seçicilik, basitlik ve yöntemin aşırı duyarlılığı onun kullanımının son yıllarda artmasına yol açmıştır. *Belirli koşullarda oluşur ve alınan cevap her zaman aynıdır. *Dalga boyu seçicisi kullanımına gerek kalmaz *Dalga boyu seçicisi olmadığından numune ile dedektör daha yakındır *Seçici ve hassas bir yöntemdir.

54 Kemilüminesans yöntemleri genellikle yüksek duyarlılığa sahiptirler
Kemilüminesans yöntemleri genellikle yüksek duyarlılığa sahiptirler. çünkü gürültü yokluğunda düşük ışık seviyeleri bile kolayca izlenebilir. Ayrıca, bir filtre veya monokromatör ile ışının zayıflaması söz konusu değildir. Gerçekte gözlenebilme sınırları genellikle dedektör duyarlılığı tarafından değil, reaktifin saflığı tarafından belirlenir. Tipik gözlenebilme sınırları milyarda bir (bazen daha az) ile milyonda bir aralığındadır. Ozon, azot oksitler ve kükürt bileşikleri gibi atmosferik kirleticilerin tayini için yüksek duyarlılık ihtiyacı sonucu, gaz bileşenlerinin tayini için kemilüminesans yöntemleri ortaya çıkmıştır. Bu yöntemlerin en yaygın kullanılanlarından biri, azot monoksit tayini için olandır; reaksiyonlar şöyledir: NO + O3  NO2 * + O2 NO2*  NO2 + hl ( nm)

55 Luminol hidrojen peroksit gibi yükseltgen bir molekülün bulunduğu ortamda mavimsi bir renk yayar. Kırmızı kan hücrelerinde bulunan hemoglobindeki demir de bu etkiyi gösterir. Bu nedenle adli tıpta kriminal incelemelerde kan izlerinin tespiti için kullanılır.

56 BİYOLÜMİNESANS

57 Canlı organizmalarda enzim-substrat ilişkisine dayanan kimyasal reaksiyonlar sonucu oluşan emisyon olayıdır. Numune Kabı Dalgaboyu seçici Dedektör Sinyal işlemci

58

59 Neden Biyolüminesans Yaparlar?
 Yırtıcılara karşı uyarı  Kamuflaj  Navigasyon  İletişim  Av çekmek

60 Cookiecutter köpekbalığı - Bu köpekbalığı yüzeye yaklaştıkça alt bölgesinden biyolüminesans yapar, böylece altından yukarı doğru bakan bir avcı tam silüetini görmez. Köpekbalığı “kayboluyor”. Ayrıca vücudunun sadece küçük bir kısmı kolayca görülebildiği için, daha küçük bir hayvana benzer ve avlamak için gelen balıkları av haline getirir. Fener balığı av çekmek için kullanır

61 FLORESANS YÖNTEMİNİN DEDEKTÖR OLARAK KULLANIMI
Düzlemsel Kromatografi Madde doğal floresant Floresant olmayan türlerin uygun bir floroforla türevlendirilmesi Uygulanan plaka floresanttır.

62 Kolon Kromatografisi Türevlendirme; Kolon öncesi Kolon sonrası Pompa
Rezervuar Pompa Kolon Işık kaynağı Uyarma dalgaboyu seçici Dedektör Emisyon dalgaboyu seçici Atık Türevlendirme; Kolon öncesi Kolon sonrası

63 Analitik Uygulamaları
*Floresans ve fosforesans yöntemleri absorbansa dayalı spektrofotometrik ölçümlerden daha düşük derişim aralıklarına uygulanabilir. Yüksek duyarlık ışık kaynağının gücünü artırmak suretiyle sağlanabilir. Ancak fotolüminesans yöntemlerinin kesinlik ve doğruluğu absorpsiyona dayalı spektrofotometrik yöntemlerden daha düşüktür. *Metal iyonlarının tayini floresans oluşturan kompleks oluşturarak yapılabilir. *Florometik analizin organik ve biyokimyasal türlere çok sayıda uygulaması vardır. Florometrenin en önemli uygulamaları, gıda ürünleri, ilaç, klinik numuneler ve doğal ürünlerin analizidir.

64 *Fosforesans ve floresans yöntemleri birbirlerini tamamlama eğilimindedirler. Çünkü, kuvvetli floresans yapan bileşikler zayıf fosforesans, kuvvetli fosforesans yapan bileşikler de zayıf floresans yaparlar. Örneğin, bitişik halkalı aromatik hidrokarbonlar arasında, halojenler veya sülfür gibi daha ağır atomları içerenler, genellikle kuvvetli olarak fosforesans yaparlar; diğer taraftan, ağır atom içermeyen aynı tip bileşikler fosforesanstan daha çok floresans yapma eğilimindedir. *Fosforimetri, nükleik asitler, amino asitler; pirin ve pirimidin, enzimler, petrol hidrokarbonIarı ve pestisitler gibi maddeleri de kapsayan çok çeşitli organik ve biyokimyasal türlerin tayini için kullanılmıştır. Bununla beraber, bu yöntem, florometri kadar yaygın kullanım alanı bulamamıştır. Bunun sebebi, düşük sıcaklıklara ihtiyaç duyulması ve fosforesans ölçmelerindeki daha zayıf kesinlik olabilir. Diğer taraftan, fosforesans işlemlerinin potansiyel olarak daha yüksek seçiciliği cezbedicidir. Davranıştaki bu farkın sebebi, etkili fosforesansın uyarılmış triplet haldeki molekül sayısını artırmak için hızlı sistemler arası geçişe ihtiyaç duyması, dolayısıyla uyarılmış singlet derişimini ve böylece de fosforesans şiddetini azaltmasıdır.

65 * Gözlenebilme sınırı: Lüminesans yöntemlerinin en cezbedici özelliklerinden birisi, absorpsiyon spektroskopide karşılaşılan bir ile üç ondalık mertebesinden daha küçük gözlenebilme sınırlan sağlayan kendilerine özgü duyarlıklarıdır. Pik gözlenebilme sınırları milyarda bir (ppb) mertebesindedir. Fotolüminesans yöntemlerin diğer bir üstünlüğü, onların geniş doğrusal derişim aralığı olup, bu da genellikle absorpsiyon yöntemleriyle karşılaşılanlardan önemli derecede daha büyüktür. Yüksek duyarlıkları sebebiyle, kantitatif lüminesans yöntemleri, sıklıkla numune matriksinden kaynaklanan ciddi girişim etkilerine maruz kalırlar. Bu sebepten dolayı, lüminesans ölçmeleri genellikle çok iyi kromatografik ve elektroforez ayırma teknikleri ile birlikte kullanılır. Floresans dedektörler, sıvı kromatografi ve kapiler elektroforez için dedektör olarak, fevkalade duyarlıkları sebebiyle, özellikle değerlidir. * Genel olarak, lüminesans yöntemleri, kantitatif analizde absorpsiyon yöntemlerinden daha az uygulanır. Çünkü, ultraviyole/görünür ışını absorplayan türler, spektrumun bu bölgesinde ışının absorpsiyonu sonucu oluşan fotolüminesans gösterenlerden çok daha fazladır.

66 a) 8-hidroksikinolin ortama hangi amaçla eklenmiştir?
Derişimi bilinmeyen ve her biri 5 mL çinko numune çözeltisi içeren balonjojelere 1,5 ppm Zn2+ içeren stok çözeltiden aşağıdaki hacimlerde ilave edilmiştir. Daha sonra üzerlerine 8-hidroksikinolin’in aşırısı eklenerek hacimleri 50 mL’ye tamamlanmış ve floresans şiddetleri ölçülmüştür. Standart Zn2+ hacmi, mL Floresans Şiddeti 12,16 5 24,51 10 38,48 15 51,68 20 63,17 25 68,11 30 56,21 35 54,13 a) 8-hidroksikinolin ortama hangi amaçla eklenmiştir? b) Yüksek derişimlerde doğrusallıktan sapma nedenlerini açıklayınız. c) Kalibrasyon doğru denklemini oluşturunuz. d) Numune içerisindeki Zn2+ derişimini hesaplayınız.

67