ARB Pozitif Balgam Örneklerinde Mycobacterium tuberculosis Kompleks Suşlarının ve İlaç Direncinin Hızlı Tanısında Multipleks Real-Time PCR Yönteminin Değerlendirilmesi.

... konulu sunumlar: "ARB Pozitif Balgam Örneklerinde Mycobacterium tuberculosis Kompleks Suşlarının ve İlaç Direncinin Hızlı Tanısında Multipleks Real-Time PCR Yönteminin Değerlendirilmesi."— Sunum transkripti:

1 ARB Pozitif Balgam Örneklerinde Mycobacterium tuberculosis Kompleks Suşlarının ve İlaç Direncinin Hızlı Tanısında Multipleks Real-Time PCR Yönteminin Değerlendirilmesi Toğrul Nağıyev1, Emel Yarar1, Begüm Kayar2, Tülin Güven Gökmen1, Farhad Kohansal Koshksaray1, Farzad Heydari1, Mahdi Marzi1, Fatih Köksal1 Çukurova Üniversitesi 1Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, 2Tropikal Hastalıklar Araştırma ve Uygulama Merkezi, Adana GİRİŞ VE AMAÇ Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ), 2013 yılı itibariyle Dünya genelinde çoklu ilaç dirençli tüberküloz (ÇİD-TB) olgusu bulunduğunu kaydetmiştir. Son zamanlarda ÇİD Mycobacterium tuberculosis kompleks (MTBK) suşlarının, ikinci seçenek anti- tüberküloz (anti-TB) ilaçlara da direnç geliştirmesiyle yaygın ilaç dirençli (YİD) suşların ortaya çıkışı en önemli insan sağlığı tehditlerinden birini oluşturmaktadır (1,2). Tedavi öncesi etken M.tuberculosis suşlarında ilaç direnç profillerinin tespiti ve ÇİD tanımına uyan suşlarda birinci veya ikinci seçenek ilaç direncinin bilinmesi gerek olgularda kürün sağlanması gerekse ÇİD suşların yayılımları ile YİD suşlara dönüşümlerinin engellenmesinde son derece önemlidir (3,4). Araştırmamızda ARB pozitif balgam örneklerinden izole edilen MTBK suşlarının birinci ve ikinci seçenek ilaç direnç paternlerinin fenotipik olarak tespit edilmesi ve doğrudan balgam örneklerinden dirençli suşların hızlı moleküler tanısında multipleks Real-Time PCR yönteminin kullanılması, böylece elde edilen sonuçların karşılaştırılması amaçlandı. BULGULAR Moleküler olarak MTBK negatif iki örnekten biri fenotipik identifikasyon sonucunda tüberküloz dışı mikobakteri, diğeri ise duyarlı MTBK, kültür ortamında mikobakteri üretilemeyen tek örnek ise moleküler olarak duyarlı MTBK tanısı aldı. Altın standart kabul edilen fenotipik incelemeler ile karşılaştırıldığında Multipleks Real-Time PCR yönteminin duyarlılığı isoniazid için %72.7, özgüllüğü ise %100 olarak bulunmuşken, rifampicin direnci için hem duyarlılığı, hem de özgüllüğü %100 olarak tespit edildi. Ayrıca ÇİD MTBK suşlarımız içerisinde fenotipik ve genotipik olarak YİD bulunmadığı, böylece, fenotipik ve moleküler inceleme sonuçlarının çok uyumlu olduğu, özellikle de ÇİD tespitinde fenotipik yöntemlere göre kullandığımız moleküler yöntemin duyarlılığının %83.3, özgüllüğünün de %100 olduğu belirlendi (Tablo 2). Tablo 2. Fenotipik inceleme ve Real-Time PCR sonuçlarının karşılaştırılması ve gruplara dağılımı Real-Time PCR Fenotipik İncelemeler MTBK (Toplam 50 örnek) Antibiyotik Duyarlılık Test (ADT) Sonuçlarına Göre Direnç Durumu* (Toplam 48 izolat) INH RIF ÇİD Poz Sayı (%) Neg R S 47(97.9) 1 (50) 11 (100) 36 (97.3) 6 (100) 41 (97.6) 1 (2.1) 1 (2.7) 1 (2.4) 8 (16.7) 8 (72.7) 5 (83.3) 3 (7.1) 40 (83.3) 2 (100) 3 (27.3) 37 (100) 1 (16.7) 39 (92.9) 6 (12.5) 6 (54.5) 42 (87.5) 5 (45.5) 42 (100) 5 (10.4) 43 (89.6) YÖNTEMLER Çalışmamıza Çukurova Üniversitesi Tropikal Hastalıklar Araştırma ve Uygulama Merkezi (THAUM) Bölge Tüberküloz Laboratuvarı’nda ARB pozitif bulunan ardışık 50 işlenmiş balgam örneği dahil edildi. Fenotipik olarak, MTBK identifikasyonunu takiben izolatların birinci seçenek anti-TB ilaç direnç paternleri BACTEC MGIT 960 sistemi ile, ÇİD MTBK izolatlarının da ikinci seçenek anti-TB ilaç direnç paternleri Lowenstein Jensen agar proporsiyon duyarlılık (APD) yöntemi ile belirlendi. APD yönteminde; antibiyotiksiz LJ besiyerlerine McFarland 1 bulanıklığındaki bakteri süspansiyonu ve 10-4, antibiyotikli besiyerilerine ise 10-2 olacak şekilde sulandırılarak 0,3’er ml eklendi ve 37°C’de inkübe edildi. ikinci seçenek ilaçlardan florokinolon grubu ilaçlardan ciprofloxacin (CIP), enjektabl ilaçlardan da amikacin sulfate (AMK) son konsantrasyonları sırasıyla 2 μg/ml ve 4 μg/ml olacak şekilde kullanıldı. İki-üç haftalık inkübasyon sonunda üremeyi 100 kattan daha fazla engelleyenler duyarlı olarak yorumlandı (üreme oranı <%1; duyarlı). Ayrıca, doğrudan balgam örneklerinde MTBK varlığını ve ÇİD/YİD durumunu multipleks Real-Time PCR yöntemi hızlı tespit etmek için yeni Anyplex™ II MTB/MDR/XDR Detection kit (Seegene) kullanıldı (Tablo1). * INH – Isoniazid; RIF – Rifampicin; ÇİD – Çoklu İlaca Direnç; R – Dirençli; S – Duyarlı SONUÇ Multiplex Real-Time PCR testi ile, doğrudan işlenmiş balgam örneğinde ÇİD, ön-YİD ve YİD MTBK tespitinin Ülkemiz için de rasyonel çözüm olabileceği görülmüştür. Mevcut rutin fenotipik incelemeler ile, identifikasyon ve ADT için geçecek süreleri de eklersek, ancak aylar sonra tanısı mümkün olabilen, böylece geç veya yanlış tedavi uygulamalarına yol açabilen, bütün dünyada ölüm oranlarında ciddi artıştan da sorumlu tutulan bu ÇİD/YİD MTBK infeksiyonlarının gözetimi ve yönetiminde giderek artan güç kaybı düşünüldüğünde, birkaç saatte sonuçlanan bu erken ve doğru moleküler tanının beraberinde getireceği ek maliyetin önemsiz kalacağı kanaatine varıldı. Tablo 1. Multipleks Real-Time PCR ile ÇİD ve YİD MTBK tespitinde kullanılan mutasyonlar KAYNAKLAR 1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report Baylan O. Extensively drug resistant and extremely drug resistant tuberculosis forms after multi-drug resistant tuberculosis: new faces of the old disease. Mikrobiyol Bul. 2011; 45(1): Köksal F. Mycobacterium tuberculosis’te direnç problemi. I.Ulusal Klinik Mikrobiyoloji Kongresi, Antalya Kasım 2011; Yu CC, Chang CY, Liu CE, Shih LF. Drug Resistance Pattern of Mycobacterium Tuberculosis Complex at a Medical Center in Central Taiwan, 2003–2007. J Microbiol Immunol Infect. 2010; 43(4):285–290. Direnç Durumu İlaç İlgili Gen Mutasyon ÇİD RIF (18 mutasyon) rpoB L511P (CTG→CCG), Q513K (CAA→AAA), Q513L (CAA→CTA), Q513P (CAA→CCA), a.a eksikliği, D516V (GAC→GTC), D516Y (GAC→TAC), S522L (TCG→TTG), S522Q (TCG→CAG), H526C (CAC→TGC), H526D (CAC→GAC), H526L (CAC→CTC), H526N (CAC→AAC), H526R (CAC→CGC), H526Y (CAC→TAC), S531L, (TCG→TTG), S531W (TCG→TGG), L533P (CTG→CCG) INH (7 mutasyon) katG S315I (AGC→ATC), S315N (AGC→AAC), S315T (AGC→ACC), S315T (AGC→ACA) InhA -15 (CT), -8 (TA), -8 (TC) YİD FQ gyrA A90V (GCG→GTG), D94G (GAC→GGC), D94N (GAC→AAC), S91P(TCG→CCG), D94H (GAC→CAC), D94Y (GAC→TAC), D94A (GAC→GCC) Injectable (6 mutasyon) rrs 1401 (AG), 1402 (CT), 1484 (GT) eis -37 (GT), -14 (CT), -10 (GA)