Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Klonlamada Plazmit Seçimi Prof. Dr. Salih Kuk Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "Klonlamada Plazmit Seçimi Prof. Dr. Salih Kuk Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı."— Sunum transkripti:

1 Klonlamada Plazmit Seçimi Prof. Dr. Salih Kuk Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı

2 Klonlamada Plazmit Seçimi Gen Klonlama nedir? Amaç Gen klonlamada temel elemanlar (Gen ve Vektör) Vektör çeşitleri (Plazmitler..) Plazmit nedir? Tarihçesi Plazmitlerin özellikleri Plazmit seçimi (tercihi)

3 Gen klonlama nedir? Yapı, Fonksiyon, Aşı gibi amaçlarla Bir genin birçok kopyasını oluşturması

4 Gen klonlamada amaç nedir? Gen izolasyonu, Gen bankalarının oluşturulması, Genlerin yapı ve fonksiyonlarının araştırılması Klonlanan genlerin üzerinde fonksiyonel bölgelerin belirlenmesi, DNA dizi analizlerinin kolaylaştırılması, DNA aşılarının oluşturulması, Rekombinant proteinlerin açıklatılması

5 Gen klonlamanın temel ilkesi 1.Bir genin vektöre yerleştirilmesi 2.Bu vektörün bakteri hücrelerine transformasyonu 3.Hücrelerin bölünmesi ve vektörün de içerdiği genin birçok kopyasını oluşturmaktadır

6 Klonlamanın temel elemanları 1.Gen Gen seçimi 2.Vektör Vektör seçimi

7 Klonlamada kullanılan Vektörler Virus Bakteriler, Bakteriofajlar, Plazmitler, Kozmid ve mayalar vektör

8 Viral vektörler Genlerin hücrelere aktarılması ve gen ekspresyon çalışmaları için virusların modifikasyonu ile oluşturulmuşlardır. Herpes, Adeno, Retro, Vaccinia, Polyoma, Baculovirus gibi birçok virus

9 Bakteriyel Vektörler S. typhimurium, E. coli, Bacille Calmette Guerin (BCG) suşu gibi bakteriler

10 Bakteriofajlar Virus olarak bilinen, Bakterileri infekte eden, Çoğunlukla DNA nadiren de RNA içeren, Proteinden yapılı, Kapsit ile çevrilmiş basit yapılardır

11 Kozmitler Cos dizisi ile mid dizisisinin laboratuvar ortamında birleştirilmesiyle oluşturulurlar 45 kb.’lik DNA’ların klonlanmasına olanak veren vektörlerdir.

12 Plazmitler ve Özellikleri Plazmid terimi Amerikalı moleküler biyolog Joshua Lederberg tarafından 1952'de ilk defa kullanılmıştır Gen klonlama çalışmalarında daha yoğun kullanılan yapılardır Bakteri ve diğer organizmalarda bulunurlar,

13 Plazmitler ve Özellikleri Konak hücre kromozomundan bağımsız olarak çoğalırlar, Küçük ve yuvarlak yapılı, Büyüklüğü 1 kb kb, Kromozom dışı çift zincirli DNA’lardır.

14 pBR322 plazmiti pBR ’de Herbert Boyer, California Ünv. lab p, plazmit BR, Post-doc "Bolivar" ve "Rodriguez”

15 pBR322 plazmiti Ampisilin ve tetrasiklin direnç genleri Birçok restriksiyon enzim bölgesi

16 pUC plazmiti pBR322’nin yarısı büyüklüğünde (daha büyük DNA’ların klonlar) pBR322’den geliştirildi

17 pUC19 ve pUC18 Messing ve ark. p, plazmit UC, University of California pUC18, pUC19’a benzer, MCS ters

18 pUC18/19

19 Hangi plazmiti kullanmalı! 1.Plazmitlerin Özellikleri 2.Kullanım Amacı

20 Gen Klonlamada Plazmit Seçimi Plazmit özellikleri Büyüklük, Kopyalama sayısı, Seçim marker, Klonlama bölgesi Üretici firmaların plazmit dizaynı

21 Plazmitlerin Özellikleri (multiple cloning site)(MCS) Birçok farklı restriksiyon enzimiyle kesilebilen polilinker bölge (multiple cloning site) içermektedirler.

22 Plazmitlerin Özellikleri (Replikasyon orjini) Plazmitlerin, bakterilerde replikasyonunu sağlayan ve birkaç yüz baz çifti uzunluğunda replikasyon orjinleri bulunmaktadır. Bu şekilde amaca göre düşük veya yüksek sayıda replike olabilen plazmitler oluşturulmuştur.

23 Plazmitlerin Özellikleri (Promotor bölgeler) Bakteriofajlardan elde edilen T3, T7, SP6 ve tac promotorları içerir Gen ekspresyon çalışmalarında kullanılacak plazmitlerin birçoğu ise, Sitomegalo virüs (SMV) promotoru ve Simian virus promotoru (SV40) içermektedir.

24 Plazmitlerin Özellikleri………… (Direnç genleri) Plazmitler ampicillin, neomicin, kanamicin gibi bir çok direnç geni içerirler

25 Plazmitlerin Özellikleri (Mavi-beyaz seçim) lac Z geni içerisinde yer alan polilinker bölgeye sokulan DNA, lac Z geninin bozulmasına sebep olarak beyaz bakteri kolonilerinin oluşmasını ve dolayısıyla rekombinant DNA’yı taşıyan hücrelerin kolaylıkla tanınmasını sağlamaktadır.

26 Gen Klonlamada Plazmit Seçimi 1977’lerden günümüze 40 yıla yakın Çok sayıda firma/vektör

27 Geleneksel Gen Klonlama pUC ve pBR gibi plazmitler Plazmit ve çoğaltılan genlerin bir veya birden çok kesim enzimleriyle kesilmesi Agaroz jelden saflaştırması ve Genin plazmite ligasyonu

28 Modern Gen Klonlama AMAÇ 1; Genin çoğaltılması ve Korunma altına alınması pJET1.2 ve TOPO  XL – Direkt PCR ürünleri – Plazmit5dk

29 pJET1.2 ve TOPO  XL

30 Modern Gen Klonlama AMAÇ 1; (Genin çoğaltılması ve Korunma altına alınması) pGEM-T, pTARGET Direkt PCR ürünü Ligasyon 1-16 saat(Bir gece)

31 pGEM-T ve pTARGET

32 Modern Gen Klonlama AMAÇ 2; Protein expresyonu pCI-neo – Enzim kesimleriyle genin yerleştirilmesi pTARGET – Direkt PCR ürününün yerleştirileceği

33 pCI-neo

34 Modern Gen Klonlama AMAÇ 3; Protein expresyonu ve pürifikasyonu pcDNA3.1/V5-His-TOPO® plazmiti – V5 epitop kuyruğu ve C-terminal 6x His dizisi pET100 plazmiti – C-terminal 6x His dizisi PinPoint Xa plazmitler – biotin proteinini kodlayan dizi içeren protein ekspresyonunun tespitinde ve pürifikasyon çalışmalarında

35

36

37

38 Modern Gen Klonlama AMAÇ 4; Protein ekspresyon seviyesinin kantitatif ölçümü  -Galaktosidaz reporter vektör, Kloramfenikol asetil transferaz reporter vektör, lusiferaz reporter plazmitlerden

39

40 Modern Gen Klonlama AMAÇ 5; Hücre içi protein trafiği Plazmit – green fluorescent protein (GFP)’ i kodlayan gen dizisini içeren

41

42 Modern Gen Klonlama Klonlama kitleri Avantajlar: Çoğu zaman ilave malzeme gerekmez – Pipet ve ucu Kontrol örnekler Optimize edilmiş protokol

43 Modern Gen Klonlama Klonlama kitleri Dezavantajlar: Maliyet Belirli reaksiyonluk – 20, 40 reaksiyon

44 Modern Gen Klonlama

45 Firma web sayfaları (Vector Selection Tool)

46 Plazmit seçimi (tercihi) Plazmitlerin özellikleri, Maliyet, Zaman, Laboratuar olanakları Bilgi ve beceri Ticari firmaların sundukları avantajlar

47 TEŞEKKÜRLER http//parazitoloji.erciyes.edu.tr


"Klonlamada Plazmit Seçimi Prof. Dr. Salih Kuk Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları