Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Danışman:Prof.Dr.Bülent BAYSAL Arş.Gör.Dr.M.Emin DEMİRCİLİ

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "Danışman:Prof.Dr.Bülent BAYSAL Arş.Gör.Dr.M.Emin DEMİRCİLİ"— Sunum transkripti:

1 Danışman:Prof.Dr.Bülent BAYSAL Arş.Gör.Dr.M.Emin DEMİRCİLİ
Tam Kanda Interferon Gama Salınımının Araştırılarak konjenital Toksoplazmozis Tanısı Danışman:Prof.Dr.Bülent BAYSAL Arş.Gör.Dr.M.Emin DEMİRCİLİ

2 Toksoplazma gondii Zorunlu hücre içi protozoon
Memelilerden kuşlara kadar geniş bir konak spektrumu İnsanlara edinsel veya konjenital bulaş Takizoit, bradizoit, ookist Bradizoit Konak hücre vakuolü içinde gelişen 40 mikron büyüklükte doku kistlerinde ortalama bradizoit Ookist Faelidae ailesi (son konak) bağırsağında parazitlerin seksüel evrimi sonucu oluşur

3 Dış ortamda, her ookist içinde ikişer sporokist ve her sporokist içinde de dörder sporozoit gelişir (enfektif form uygun koşullarda 5-8 günde). Oda sıcaklığında aylarca canlı kalabilirler Konjenital bulaş Plasentadan trofozoit geçişi ve bulaş 3. trimestreye doğru giderek artar .Bebeğin etkilenmesi en çok ilk trimestrede Edinsel bulaş Takizoitler (kan transfüzyonu, laboratuvar kazaları) Doku kistleri (sığır, koyun, domuz etlerinin çiğ, az pişmiş veya dondurulmadan yenmesi) Ookistler (kontamine yiyecek, içecek ve ellerle)

4 Klinik Konjenital toksoplazmoz
Neonatal hastalık (Hidrosefali, mikrokalsifikasyonlar, koryoretinit) Yaşamın ilk haftalarında oluşan hafif veya ağır hastalık Bebeklik, çocukluk veya adolesansta, önceden tanınmamış infeksiyonun sekel veya relapsı Subklinik infeksiyon Oküler toksoplazmoz

5 Toksoplazmoz tanısı İmmunokompetan olanlarda Asemptomatik
Enfeksiyoz mononükleoz benzeri bir tablo Poliadenopatili ateşsiz şekil Nadiren ağır infeksiyon Toksoplazmoz tanısı Direkt Kan, vücut sıvı ve dokularından izolasyon Sitolojik preparatlarda takizoit ve/veya antijenlerin gösterilmesi Plasenta, fetus veya yenidoğanda takizoit veya bradizoitleri içeren kistlerin gösterilmesi PZR İndirekt serolojik testler

6 Serolojik testler Kullanılan antikorlar IgG IgM IgA (yenidoğanda)
IgE (immunkompromize hastalarda) İFAT İHA Anti-toxoplasma IgM ELISA (özellikle immunocapture) IgM, IgA, IgE Anti-toxoplasma IgG ELISA IgG avidite

7 Toxoplasma gondii, konjenital infeksiyonlu kişilerde ciddi morbidite ve mortalite nedenidir
İnfekte yenidoğanlar doğumda asemptomatik olabilir fakat adölesan ve çocukluk döneminde retinal hastallıklar gelişme riski vardır

8 Bu hastalarda hastalığın tanısı çoğunlukla spesifik antikorların tespitine dayanmaktadır
Plesental geçişi olmayan Toxoplasma spesifik IgA ve IgM konjenital infeksiyon için iyi bir gösterge olarak kabul edilir Bununla birlikte maternal infeksiyonda gestasyonal yaş testin performansını etkilemektedir ve doğumda test infekte bebeklerin %75 ten fazlasını tespit edememektedir

9 Toksoplazma spesifik IgG plesentaya geçtiğinden yenidoğan kanındaki varlığı konjenital infeksiyonun bir kanıtı olarak değelendirilmez Anneden geçen IgG’ler genellikle 6-12 ay içerisinde kaybolmaktadır Bu yüzden gebeliğinde serokonversiyonu olan annelerden doğan,infekte olmayan bebekler konjenital toxoplazmozis dışlanmadan önce bir yıl boyunca serolojik teslerle düzenli olarak takip edilmelidir

10 T. gondi infeksiyonu interferon gama üreten T lenfositlerin effektör aktivitesine bağlı olan uzun süreli hücresel immuniteyle sonuçlanmaktadır Birkaç çalışma hastalığın tanısında hücresel immunitenin potansiyel rolünü araştırmıştır.Fakat literatür bilgileri çelişkilidir Konjenital infekte çocuklarda ki T. gondi antijenleri tarafından lenfositlerin uyarılmaması daha önceden bildirilmiştir

11 Yakın zamanda (Guglietta et al
Yakın zamanda (Guglietta et al.) bir çalışmada sentetik peptidleri kullanarak konjenital infeksiyonlardaki parazitik antijenlere karşı spesifik T hücre yanıtının yaş ile ilişkili bozukluğunu saptamışlardır Buna karşıt olarak başka bir çalışma konjenital toksoplasmozisin erken ve doğru tanısı için T hücre immunite değerlendirmesinin önemli olduğunu bildirmektedir Flow sitometri ile CD25 ekspresyonunun saptanması ile yenidoğanlarıda içeren hemen hemen tüm hastalarda spesifik hücresel immunitenin saptanabilir olduğu daha önceden gösterilmiştir

12 Bu çalışmada çalışma konjenital toxoplasmozisin tanısı için tam kanda IFN-gama salınımı analizinin performansı değerlendirilmiştir

13 Gereç&Yöntem Grup 1) Grup 1’deki hastalar bebekleri test etmeden önce tekniğin geçerliliğini kontrol etmek için pilot çalışmada kullanılmıştır Bu çalışma Hoˆpital de la Croix Rousse, Lyon,France başvuran 172 hastadan oluşmaktadır ve toxoplasma serolojisi için test edilen hamile kadınları da içermektedir 58 hastada infeksiyon saptanmamıştır(negatif serolojik test) 114 hasta ya kronik infektedir yada yakın zamanda serokonversiyon göstermiştir(Pozitif test)

14 Kan hücreleri ile IFN-gama sekresyonu analizini ilk önce final konsantrasyonu 1.5,3,6 µg/ml olacak şekilde T. gondi antijenleri kullanılarak araştırılmıştır Bu konsantrasyonlar arasında 3 µg/ml sensivite ve spesifite için en iyi sonucu saptamıştır.Çalışmada bu konsantrasyon kullanılmıştır

15 Serum ayrılmasından 24 saat sonra oluşan örnekler,ayırmadan 24 saat içindeki örneklerle karşılaştırıldığında düşük IFN-gama uyarısı gözlemlenmiş Çalışmada 479 test uygulanmış.Sonuçların 252’i (%5) PHA stimülasyonuna pozitif yanıt yetersizliği veya IFN-gama spontan sekresyonuna bağlı olarak geçersiz sayılmıştır

16 Grup2)Grup 2 gebeliği boyunca serokonversiyon gösteren annelerden doğan 1 yaş altı 62 infantı içermektedir Konjenital toksoplazmozis tanısı; 17 olguda amniyotik sıvıda (+) PCR sonucu olan,perferik kanda IgM veya IgG varlığı,anne ve yenidoğanda karşılaştırılmalı Western blot pozitifliğine,1 yaşından sonra spesifik IgG varlığına dayanarak konmuştur

17 Çalışmanın protokolüne göre,tüm hastalara hem klinik hemde oftalmolojik muayene yapılmış, hem de hastalara ilk yıl boyunca her 3 ayda bir serolojik testler uygulanmıştır İnfeksiyon 1 yaşında serolojik tesleri negatif olan, doğumda ve in-utero testleri negatif olan 45 çocukta ekarte edilmiştir

18 Grup3) Konjenital infeksiyonu olan 1-30 yaşındaki 124 hastayı içermektedir.Hepsi yıllık olarak düzenli klinik ve oftalmolojik muayeneye tabi tutulmuştur.Bunların 31’inde okuler lezyonlar,8’inde serebral kalsifikasyonlar vardı Serolojik araştırmalar: Toksoplazma spesifik IgG ve IgM antikorları Enzygnost toksoplazmozis ELİSA (ELISA; Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany) kullanılarak yapılmıştır

19 Boya uyumsuz test sonuçları olan örneklerde yapılmıştır
T hücre stimülasyonu; Solubl Toxoplasma gondii antijenlerinin hazırlanması; RH suşunun Toxoplasma gondii parazitleri OF1 farelerinin peritoneal kavitelerinden elde edilmiştir.Asit sıvısı infeksiyondan 2 gün sonra toplanmıştır ve 0.2-µm por genişliği olan membranlardan geçirilerek -20C˚’de saklanmıştır

20 Kan örnekleri stimülasyonu; Periferik kandan 1ml örnek lityum heparin antikoagülanı içeren vacutainer tüplere koyulmuştur (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ) Tüpler oda ısısında 1600 devirde 15 dakika santrifüj edilmiştir Serum serolojik araştırmalar için toplanmış ve RPMI medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)’un aynı hacmi ile replese edilmiştir

21 Dilüe kanın 300µl’si Toxoplasma gondii antijenlerinin farklı konsantrasyonları varlığında steril propilen tüplerde(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)kültürü yapılmıştır Bütün kültürler %5’lik CO2 ortamdac 37C˚’de 24 saat inkübe edilmiştir IFN-gama analizi ticari ELISA kiti (AbCys, Paris, France) kulanılarak yapılmıştır

22 SONUÇLAR Grup1)Şekil 1 grup1’deki 114 infekte hastada ki IFN-gama sekresyonunun, infekte olmayan 58 hastadan anlamlı olarak daha yüksek olduğunu göstermektedir Testin sesivitesi %96,spesifitesi %91 dir Negatif serolojisi olan hastalar arasında 5’i arasında değişen zayıf IFN-gama seviyelerini göstermektedir.5 hastanın tamamıda spontan olmayan IFN-gama sekresyonu yapmaktadır ve inflamatuar sendromları yoktu

23

24 Bu kişilerden ikisi tekrarlayan testlerde IgG olmadan IgM varlığı ile birlikte atipik serokonversiyon profiline sahip hamile kadınlardı Her ikisinede IgM varlığına dayanarak yakın zamanda infekte olduğu düşünülmüş ve spiramisin tedavisi verilmiştir Toxoplasmozis testi pozitif olan hastalar arasından 5’i (+) PHA testine rağmen negatif IFN-gama yanıtı vardı ve hastaların kayıtlarında anerji ve imunsüpresyonun hiçbir kanıtı yoktu

25 Grup 2)Çalışmada ki ilk testten, 17 infekte infant infekte olmayan infantlardan anlamlı olarak daha yüksek seviyede IFN-gama düzeyi göstermiştir ROC eğrisine göre 1 pg/ml’nin üzerindeki değerler pozitif olarak kabul edilmiştir Bu şartlar altında 17 infekte bebeğin 16’sı pozitif IFN-gama düzeylerine sahiptir Bunlar arasında 5 infant yaşamlarının 3 haftalık ve 3 aylık dönemleri arasında subklinik infeksiyon tanısı almıştır.2 olguda bu konjenital infeksiyonun tek pozitif kriteridir

26 Anneler gebelik boyunca farklı periyotlarda serokonversiyon göstermişlerdir ve hepsine toxoplasmozis için antenatal tedavi verilmiştir 45 infekte olmayan infant içinde 44’ünde negatif cevap elde edilmiştir.Bu klinik bulgularla testin sensivitesi %94 ve spesifitesi %98 di. Tedavi altında ki 2 bebekte test sonuçlarının geçici negatifliği dışında 62 bebekte izlem sonuçları tanıyla uyumluydu.Aynı zamanda serolojileri negatifti Tedavinin bitiminden sonra hem IFN-gama hemde IgG titrelerinin her ikisinde dramatik bir artış göstermişlerdir

27 Grup 3) Konjenital olarak infekte kişilerin 172’sinin tamamı 2,285-9 pg/ml arasında değişen IFN-gama seviyeleri ile birlikte pozitif test sonuçları elde edilmiştir IgG titreleri ve IFN-gama seviyeleri arasında anlamlı olmayan bir korelasyon vardı

28 TARTIŞMA Çalışmada T hücrelerinin Toxoplasma gondii antijenlerinin stimülasyonuyla oluşan IFN-gama yanıtını ölçmek için invitro bir araştırma yapılmıştır Test sadece 1 ml kan gerektirmekteydi.Bu nedenle yeni doğanlara uygulanması için uygundu Bunun yanında pozitif ve negatif kontrolle birlikte IFN-gama analizine ek olarak (PHA- PBS),serolojik testler aynı kan örneği ile yapılabiliyordu

29 Geçersiz test sonuçları olarak PHA tüplerindeki pozitif yanıt yetersizliğine veya kontrol tüpündeki spontan IFN-gama sekresyonuna bağlı olarak %5 oranındaydı, geçersiz sonuçlar, başlıca yetişkinlerde gözlemlenmiştir Akut veya kronik infeksiyonu olan seropozitif hastalar infekte olmayan hastalara göre anlamlı olarak daha yüksek IFN-gama düzeyleri göstermiştir IFN-gama’nın spontan sekresyonu olmayan 5 örnek sonuçları IgG serolojisiyle karşılaştırıldığında yanlış pozitiflikler belirlenmiştir

30 IFN-gama değerlendirilmesi gebe kadınlarda karşılaşılabilen belirsiz serolojik düzeyin yorumlanmasına sağlayabilir Daha önceden T. gondii antijeninin seronegatif kişilerdeki işaretlenmiş T hücre proliferasyonunu ortaya çıkarabildiği gösterilmiştir .Bu proliferasyonun poliklonal olduğu görünmektedir ve coccidan bir patojen ile birlikte çapraz reaksiyonla sonuçlanabilir.Antijen pürifikasyonu testin spesifikliğini arttırabilir

31 Yanlış negatif sonuçları olan beş hasta immunsüprese değildi ve hepsi PHA’ya pozitif yanıt verdi
Lenfosit sayıları normal seviyelere düşmüştü fakat CD4 fenotiplemesi oluşmamıştı Bunların hepsinde kr. toksoplazma infeksiyonu vardı ve yanıt yetersizliği daha önceden bildirilen tüberküloz hastaları gibi aktif hastalıkla ilişkili imunsüpresyona bağlı değildi

32 Gebeliği sırasında infekte olan annelerden doğan 1 yaş altı bebekler için ilk testin sonuçları %94 sensivite,%98 spesifite göstermektedir Test infekte olmayan bebeğin 44’ünde hastalığı ekarte etmiştir Yaşamın ilk yılında IgG taraması gereksiz bulunmuştur Tek yanlış pozitiflik klinik inflamatuar hastalığı olmayan geçici pozitif test sonucu olan 6 aylık bir bebekte gösterilmiştir.Bu hastanın daha sonraki testleri negatif çıkmıştır

33 İnfekte olmayan 17 bebeğin 16’sı testle teşhis edilmiştir
3 ayın altındaki 2 bebekte IFN-gama sekresyonu infeksiyonun tek işaretiydi ve tedavi kararını etkilemekteydi Bu veriler göstermiştir ki bebekler için IFN-gama salınımı konjenital toksoplazmozisin iyi bir göstergesidir Tek yanlış negatif sonuç tedavi bitiminden sonra IFN-gama yüksekliği gösteren 8 aylık bir bebekte belirlenmiştir

34 Şekil 4’te gösterildiği gibi IgG titreleri IFN gama titreleriyle paraleldir

35 Bu antikor profili tedavi alan hastalarda yaygın olarak gösterilmektedir
Bu patern parazit kistlerinden orijin alan antijenlerin azalmasına veya primetamin ve sulfanomidin mitokondriyal apopitotik yolun aktivasyonu için aktif lenfositler üzerinde direkt etkisine bağlıdır Bebeklerde gözlenen ilaç düzeylerindeki büyük farklılık bu fenomenin tüm bebeklerde neden gözlenmediğini açıklamaktadır

36 İnfeksiyondan 30 yıl sonra grup 3’teki subklinik hastalarda yeterli IFN-gama yanıtı kan dolaşımındaki spesifik effektör T hücrelerini belirleyen kistler tarafından üretilen devamlı parazitik antijenin bir belirtecidir Hastalığın akut fazı özellikle Th1 yanıtı gibi immunsistemin baskısı alındaki yavaş replike olabilen bradozoitlerden farklılık gösteren hızlı replike olan takizoitlerin varlığı ile karakterizedir

37 Bradozoitler farklı dokularda kistlere dönüşür ve hayat boyu persiste kalır
Her iki parazitik durumda da spesifik antijenler eksprese edilir

38 Sonuç olarak toksoplazmik antijenler ile tam kanın stümülasyonundan sonra IFN-gama yanıtının değerlendirilmesinin yenidoğanlarda konjenital toksoplazmozis tanısı için kolay uygulanabilir basit bir test olduğu gösterilmiştir Bu test doğumda konjenital infeksiyonu güvenilir bir şekilde ekarte etmektedir ve gereksiz anksiyete ve serolojik takiplerden kaçınılmaktadır Tersine pozitif sonuç verildiğinde infeksiyon sekelini azalttığına inanılan erken tedavi kararına neden olmaktadır

39 Testin performansını arttırmak için pürifiye antijenlerin veya sentetik peptidlerin kullanımı araştırılmalıdır Testin sensivitesini tam olarak değerlendirmek için ek vakalara ihtiyaç vardır

40 teşekkürler


"Danışman:Prof.Dr.Bülent BAYSAL Arş.Gör.Dr.M.Emin DEMİRCİLİ" indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları