Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Semen analizinde araştırma test prosedürleri ve genetik testler Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "Semen analizinde araştırma test prosedürleri ve genetik testler Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim."— Sunum transkripti:

1 Semen analizinde araştırma test prosedürleri ve genetik testler Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, 2014 TKBD-Semen Analizi Kursu

2 Sunum Planı  Semen analizinde araştırma test prosedürleri Reactive oxygen species (ROS) Reactive oxygen species (ROS) Sperm Penetration Assay (SPA)Sperm Penetration Assay (SPA) DNA Hasarı (Comet Assay)DNA Hasarı (Comet Assay)  Genetik testler Y-Kromozom Delesyonu Fluorescent In situ Hybridization (FISH)Fluorescent In situ Hybridization (FISH)

3 Semende ROS  Bu test semendeki reaktif oksijen radikalleri (ROS) miktarını belirlemek amacıyla yapılır  superoxide anion ( O 2 – )  hydrogen peroxide (H 2 O 2 )  hydroxyl radical ( OH)  hypochlorite radical ( OHCI)  ROS luminometre veya spektrofometre ile değişik parametreler kullanılarak ölçülebilir.

4 ROS luminometre prosedürü  Semen numunesi alındıktan hemen sonraki 30 dakika içinde testin yapılması gerekmektedir.  ROS luminometre kullanılarak relative light units (RLU) olarak ölçülebilir.  Fazlaca arttığı durumlarda ROS;sperme direkt olarak, lipid peroksidasyonu yoluyla ve DNA hasarı yaratarak zarar verir.  Ancak fizyolojik koşullarda ROS sperm kapasitasyonu ve akrozom reaksiyonu için gereklidir.

5 Sperm Penetration Assay (SPA)  Bu test ile spermin hamster yumurtasını penetre etme yeteneğine bakılarak, spermin insan yumurtasını dölleme potansiyeli ölçülmektedir.  1989’dan beri uygulanmaktadır.  Çalışmalarda SPA test pozitifliği ile IVF başarısı arasında korelasyon gösterilmiştir.  Ancak testin yanlış negatif sonuçların olması başarısını azaltmaktadır.

6 SPA Prosedürü  Hasta spermi test yolk buffer (TYB) içinde 48 saat bekletilir.  Dişi hamstırlarda ovulasyon indüksiyonu yapılır.  Hasta spermleri yıkanır ve swim-up prosedürü uygulanır (90 dakika 37 C ‘de inkübe edilir).  Toplanan hamstır yumurtaları hyalüronidaz ile işleme tabii tutularak kumulustan ayrılır. Arkasından tripsin ile işleme tabii tutularak zona uzaklaştırılır.

7 SPA Prosedürü  Zonası uzaklaştırılan hamstır yumurtaları ve spermler beraberce 37 0 inkübe edilir.  Yumurtalar yıkanır ve lam üzerine alınır.  Her bir yumurtayı penetre eden sperm sayısı kaydedilir.Bu sayı 5’ten büyük ise test normal kabul edilir.

8

9 DNA Hasarı  Diğer testleri normal olan pek çok sperm örneğinde DNA hasarı (fragmentasyon) olabilir.  İnfertil erkeklerin spermlerinde yüksek düzeyde DNA hasarı gözlenmektedir 1.  Ayrıca DNA hasarı embriyo bölünmesinde bozulma 2, açıklanamayan infertilite ve tekrarlayan erken düşük ile ilişkilidir. 1 Irvine DS, et al, 2000; 2 Morris ID, et al, 2002

10 TESTPRENSİP TANIMLAMA YÖNTEMİ AVANTAJDEZAVANTAJ Sperm Chromatin Structure Assay® SCSA) (SCSA) or DNA Integrity Assay Susceptibility to DNA denaturation Flow cytometry Correlation to other tests Standardized High sensitivity Clinically significant Large number of cells analyzed Special equipment Acridine Orange Test Acridine Orange Test (AOT) Susceptibility to DNA denaturation Fluorescent microscopy Simple Inexpensive Indistinct colors Poor correlation with other test Interlaboratory variations Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated Deoxyuridine Triphosphate Nick TUNEL) End Labeling (TUNEL) Single- and doublestrand breaks Fluorescent microscopy- Bright field microscopy Flow cytometry Correlation to other tests Standardized High sensitivity Clinically significant Special equipment Interlaboratory variations In Situ Nick Translation (ISNT) Single-strand breaks Specific to endogenous breaks Clinically not proven Comet assay Comet assay (neutral and alkaline) Single- and double strand breaks (double-strand breaks for neutral) Single-cell gel electrophoresis Fluorescent microscopy High specificity Quantification of DNA damage in individual cell Interlaboratory variations Time consuming Not standardized 8-Hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) Assay Measurement of DNA oxidation Detecting 8-OHdG High performance Liquid chromatography Flow cytometry Quantitative High specificity Special equipment Artifactual oxidation

11 Comet Assay Test Prosedürü (Single-cell gel electrophoresis assay)  Sperm agaroz jel ile karıştırılır ve slayt üzerine yayılır.  Sperm alkali ortamda eritilir ve denatüre edilir.  Slayt elektroforeze tabii tutulur.  Daha sonra etanol ile dehidrate edilir ve Syber green boyası ile boyanır.  Normal :≤ % 27

12 Comet Assay NormalDNA Hasarı %100 L. Murthy

13 TKBD-Semen Analizi Kursu

14 Genetik Testler  Genetik nedenler erkek infertilitesinde %15 oranında tespit edilmektedir.  Sperm konsantrasyonu <10x10 6 ise genetik testler önerilir TKBD-Semen Analizi Kursu

15 Genetik Testler  Kistik Fibroz Gen mutasyonları (KBVDY)  Yq kromozomu mikrodelesyonları (Azospermi/ağır oligozospermi)  Kromozom anormallikleri (Klinefelter sendromu) TKBD-Semen Analizi Kursu

16 Y-Kromozom Delesyonu  Y Kromozom mikrodelesyonlarına azospermik (8-12%) ve oligospermik erkeklerde (6%), nadiren de fertil erkeklerde rastlanmaktadır.  Y-Kromozom delesyonu olan ve ICSI düşünen hastaların, erkek çocukları azospermi açısından yüksek riske sahiptirler.

17 Test Prosedürü Kullanıma hazır ekstraksiyon kiti(Gentra sistem) ile DNA elde edilir. PCR (multiplex rxn) yapılır. PCR ürünleri agaroz jelde yürütülür TKBD-Semen Analizi Kursu 17

18 A Primer B Primer 1 2 SRY SY257 SY134 SY255 SY269 E1FAY SY143 SMCY SY149 SY243 1-Patient with deletions 2-Normal L.Murthy TKBD-Semen Analizi Kursu

19 AZFa ve AZFb delesyonları testiküler sperm eldesi açısından negatif prognostik değer taşır.  AZFc delesyonu olan hastalarda %50 oranında testiküler sperm eldesi şansı vardır TKBD-Semen Analizi Kursu

20 Fluorescent In situ Hybridization (FISH)  Bu prosedürde, dekondanse sperm nükleuslarının yapısını indirekt olarak belirleyen DNA-spesifik işaretli prob kombinasyonları kullanılmaktadır.

21 Sperm kromozom anomalileri Sex Chromosome disomy21 disomy18 disomy13 disomyDiploid sperm

22 FISH Prosedürü  Spermlar yıkanır ve slayda fikse edilir..  Sperm baş bölgesinin kompakt kromatin içeriği dekondanse edilir. Disülfit bağlarını kırmak için dithiothreithol (DTT) kullanılır.  DNA prob kitleri kullanılır.  CEP 18,X,Y probu x,Y ve 18. kromozomda sentromerik bölgedeki dizileri belirler.  LSI 13,21 probu 13 ve 21.kromozomdaki dizileri belirler.

23 Normal Y,18 Normal X, TKBD-Semen Analizi Kursu 23

24 Abnormal: XY18 Abnormal X,Y, TKBD-Semen Analizi Kursu 24

25 Disomy 18: XY,18-18 Disomy 18 XY, TKBD-Semen Analizi Kursu 25

26 Normal haploid: 13, 21 Normal haploid; 13, TKBD-Semen Analizi Kursu 26

27 Disomy 21: 13, Disomy 21: 13, TKBD-Semen Analizi Kursu 27

28 DDiploid; 13-13, TKBD-Semen Analizi Kursu 28

29 Teşekkür ederim…


"Semen analizinde araştırma test prosedürleri ve genetik testler Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları