Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

... konulu sunumlar: "Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı"— Sunum transkripti:

1 Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
HIZLI VİRAL TANI TESTLERİ Doç. Dr. Dilek Çolak Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji Bilim Dalı FEN Ankara

2 Virolojik Tanı Yöntemleri
Direkt tanı yöntemleri İndirekt tanı yöntemleri

3 Virolojik Tanı Yöntemleri
1. Direkt Tanı yöntemleri Direkt inceleme Histoloji Sitoloji Elektron mikroskobisi yöntemi Hücre kültürleri Antijenlerin saptanması İmmün boyama (-floresan, -peroksidaz, vb) ELISA Lateks agl. Nükleik asitlerin tayini Moleküler testler

4 Virolojik Tanı Yöntemleri
2. İndirekt Tanı Yöntemleri Özgül antikorların araştırılması IgM IgG IgG avidite serum, BOS, vb

5 Sitoloji: Virus grubu ! Tzanck smear HSV - VZV

6 Sitoloji: İntranükleer inklüzyonlar CMV

7 Elektron Mikroskobisi Yöntemi
Dışkı Rotavirus, Adenovirus Vezikül sıvısı HSV, VZV

8 Elektron Mikroskobisi Yöntemi
Adenovirus Rotavirus (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

9 Elektron Mikroskobisi Yöntemi
Direkt görüntü Virus karekterizasyonu Hızlı Ayrdedici Pahalı Duyarlılık 106part./ml Araştırma lab. İmmün Elektron Mikroskobisi

10 Hücre kültürleri Konvansiyonel CPE

11 Hücre kültürleri Geç sonuç (1-30 gün)
Örnek kalitesi ve transportu çok önemli Kontaminasyon riski Örneklerin toksik etkisi Üremeyen viruslar

12 Hücre kültürleri Hızlı hücre kültürleri CMV saat

13 Viral Antijenlerin Saptanması
İmmünfloresan boyama (FAT) EIA Lateks agl. Hızlı Canlı virusa gerek yok

14 Viral Antijenlerin Saptanması
RSV Influenza Parainfluenza Adenovirus HSV Varicella-zoster CMV Rotavirus HBV

15 Viral Antijenlerin Saptanması
Nazofaringeal aspirat Dışkı Deri Kan RSV Influenza A and B Parainfluenza Adenovirus Rotaviruses Adenoviruses HSV VZV CMV (pp65 antijenemi testi)

16 Viral Antijenlerin Saptanması
İmmünfloresan boyama

17 Viral Antijenlerin Saptanması
FAT Deride HSV (DFA) (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

18 Viral Antijenlerin Saptanması
Periferik kan lökositleri CMV antijenemi testi; CMV pp65 antijeni 3-4 saat Ciddi lökopenide yetersiz kalır!

19 pp65 antijenemi testi

20 Viral Antijenlerin Saptanması
FAT RSV Influenza A

21 Duyarlılık Özgüllük PPD NPD FAT 80 93.3 92.3 95.1
HSV 1-2; Duyarlılık Özgüllük PPD NPD FAT Shellvial-IP Kon.kültür Chan EL et al. Clin Diagn Lab Immunol 2001;8:

22 1188 nazal yıkama örneği  sitospin preparatı FAT x Hızlı hücre kült.
% Virus Duyarlılık Özgüllük PPD NPD ADV Infl.A Infl.B PI.1,2, RSV Toplam Rochol C, et al. Pediatrics 2004;113:e51-e56

23 FAT yönteminde: Örnek kalitesi çok önemli Örnekte yeteri kadar hücre olmalı “yalancı negatif sonuç” Deneyimli personel gerekli Çok sayıda örneğin incelenmesi zor

24 Viral Antijenlerin Saptanması
EIA

25 Viral Antijenlerin Saptanması
EIA Çok çeşitli örnek çalışılır Fazla sayıda örnek çalışılır Otomasyon

26 Viral Antijenlerin Saptanması
Membran EIA

27 Viral Antijenlerin Saptanması
Lateks aglütinasyon

28 Nükleik Asit Tayini Moleküler testler Polimeraz zincir reaksiyonu
Klasik PCR Real-time PCR Hibridizasyon

29 Nükleik Asit Tayini Klasik PCR

30 Nükleik Asit Tayini

31 Nükleik Asit Tayini Real-time PCR                                        

32 Plato fazı Geçiş fazı Sinyal Logaritmik faz Eşik çizgisi Baz çizgisi 10 20 30 Döngü sayısı

33 Nükleik Asit Tayini Amplifikasyonla ilişkili floresan sinyallerinin
Real-time PCR Amplifikasyonla ilişkili floresan sinyallerinin alınması için gereken siklus sayısı (Ct değeri), başlangıçtaki hedef nükleik asit miktarıyla ters orantılı

34 Nükleik Asit Tayini Real-time PCR ürün saptama SYBR green I
Fluorescense resonance energy transfer (FRET) Hibridizasyon probları Taq-man probları Molecular beacons

35 SYBR green

36 FRET

37 Taq-man probları

38 Molecular Beacons

39

40 Hybrid capture CMV DNA testi
1-DNA ekstraks. Tam kan 4- Konjugat 2-Hedef DNA’nın CMV RNA probu ile hibridizasyon 5.Kemilüm. saptama 3-DNA: RNA hybridlerinin antikorla tutulması by antibody

41

42 ADV, 37 konjonktival sürüntü örneği
% Test Duyarlılık Özgüllük PPD NPD H.kült FAT PCR Percivalle E, et al. J Clin Virol 2003;28: FAT (-)  diğer testler

43 ADV, >5000 örnek  perif. kan lökositleri Real-time PCR dışkı idrar
132 KHT alıcısı ADV, >5000 örnek  perif. kan lökositleri Real-time PCR dışkı idrar boğaz sürüntüsü Periferik kan löokositlerinde PCR (+) İnvaziv ADV inf. göstergesi Lion T, et al. Blood 2003;102:

44 Tedavi monitörizasyonu
Moleküler testler: Avantajları Hızlı Duyarlılık yüksek “latent viruslar için kantitatif testler” Pek çok patojen için uygulanabiliyor Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski çok az “MagnaPure+LightCycler” Tedavi monitörizasyonu

45 Moleküler testler: Dezavantajları
Çoğu standardize değil “internal ve eksternal kalite kontrol uygulamaları” Lab.lar arası sonuç karşılaştırması zor “tanı karmaşası” PCR temelli olanlarda IC kullanılmalı Rutin sonuç verirken dikkat! Pahalı Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski fazla “in house PCR”

46 Seroloji: BOS’da antikor tayini: Herpesviruslar Respiratuvar viruslar
İntratekal antikor sentezi olduğu gösterilmeli BOS spesifik Ab :serum spesifik Ab BOS IgG:serum IgG  1.5

47 İletişim Laboratuvar klinik Toplantılar Karşılıklı bilgilendirme
Hasta bilgileri paylaşılmalı .....

48 Yorum Elde edilen sonuçlar neyin göstergesi ne diyor şimdi n’olacak?
Mikrobiyolog yaptığı testin sonucunun yorumunu yapabilmeli Klinisyen istediği testin sonucunun yorumunu istemeli, öğrenmeli

49 “Rekabet ile işbirliğini harmanlayıp;
düşleri ortak bir gerçekliğe aktarmak...” Bahar Ö. Düzgören

50