Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: Toraks 11.Yıllık.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: Toraks 11.Yıllık."— Sunum transkripti:

1 IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008

2 Amaç •Deneysel araştırmada in vitro yöntemler ve kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi olma •Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi sahibi olma •Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi olma •Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme

3 Sunu Akışı •Giriş; –Araştırma laboratuarı –Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? •Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri •Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Özet

4 Sunu Akışı •Giriş; –Araştırma laboratuarı –Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? •Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri •Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Özet

5 İn Vitro Araştırma Laboratuarı •Nasıl kurulur? •Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK •Profesyonel destek •Personel; biyolog, teknisyen, asistan

6

7

8

9

10 İn vitro yöntemler nerede kullanılır? •İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi; –Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs. –Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL –Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusu •İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde edilmesi ve incelenmesi –Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler, eozinofil vs –Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre kültürleri vs

11 İn Vitro Yöntemler Niçin Kullanılır? •Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs •Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya titreşimi, elektriksel direnç, permabilite •Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue •Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot •Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi: PCR, RT-PCR •Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya •Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre) ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’)

12 Sunu Akışı •Giriş; –Araştırma laboratuarı –Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? •Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri •Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Özet

13 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)/Enzyme ImmunoAssay (EIA) (‘capture ab’) (Nümune) (‘detecting ab’) (‘enzime bağlı secondary ab’) (Substrat)

14 ELİSA

15 ImmunoSito/Histokimya Enzimatik Yöntem Floresan Yöntemi

16

17 ‘Blotting’ (leke) •Southern blot; DNA dizisi (sequence,sekans) •Western blot; protein antibody ile •Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile •Southwestern blot: DNA bağlı protein •Far-western blot: Protein, non-antibody protein ile

18 Western Blot (Immunoblot) •Doku homojenatı/ekstraktı, hücre •Spesifik proteini, düzeyini belirlemek

19 Polymerase Chain Reaction (PCR)

20 Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) •Quantitative real time polymerase chain reaction (QRT-PCR) •Kinetic polymerase chain reaction •Hedef DNA’yı eş zamanlı olarak amplifiye ve kuantifiye eder. •Anahtar özellik, amplifiye edilen DNA biriktikçe, her amplifikasyon siklüsü sonrasında eş zamanlı olarak ölçülebilmektedir •Karşılaştırma yapılabilmektedir

21 Microarray (Mikrodizi) •DNA microarray’leri; cDNA microarray, oligonucleotide microarrays •Protein mikroarray •Tissue mikroarray •Transfection mikroarray (hücre microarray) •Kimyasal bileşik mikroarray •Antibody mikroarray •Gene Chip Analizleri

22 DNA Mikroarray •Gen/genom chip, DNA chip, gen array •Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA spotlarının bir kolleksiyonu •Diğer arraylar’dan farkı ya DNA’yı ölçer, ya da ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA’yı kullanırlar.

23 Genomic •Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması •Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans) tespitine dayalı çalışmalar

24 Proteomic •‘Genomic’ ile analoji yaratmak amacıyla kullanılır • Genel olarak protein çalışmaları (yapı ve fonksiyonları) • ‘Proteome’; ‘ prote in’ ve ‘gen ome ’ dan oluşur. •Bir organizma tarafından üretilen tüm proteinler

25 Small Interfering RNA (siRNA) •‘short interfering RNA’ veya ‘silencing RNA’ • Spesifik rolleri olan nükleotid uzunluğunda çift-sarmal RNA moleküllerinden oluşur. • siRNA transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek Spesifik geni etkisizleştirme de (knock down) kullanılabilir

26 Flow Cytometry •DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs) •Apopitozis çalışmalarında •Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde (CD markerları) •Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs) •Kromozom analiz ve tespitinde •RNA çalışmalarında •Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda

27 support/training/online/ITF/index.shtml

28 •Tek dalga ışın demeti(lazer) sıvı akımına yönlendirilir •Çevredeki detektörler ışığın kırılma yönü, yaydığı floresan ışığının tespitiyle hücre/partiküllerin belirlenmesi esasına dayanır Akım Sitometri (Flow Cytometry)

29 Hücre Siklüs Ölçümü

30 Sunu Akışı •Giriş; –Araştırma laboratuarı –Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? •Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri •Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Özet

31 Hücre Kültürleri •İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik sorunları •Uygun çalışma modeli •Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb •Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser •Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas •Terapötik; Ca tedavisi, steroidler,  2 - agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs

32 Hücre Dizileri (‘cell line’) •Avantajları; –Elde edilmeleri kolay –İstendiği kadar çoğaltılabilir –Saklanabilir, tekrar kullanılabilir –Belli pasaj aralıkları kullanılmalı •Dezavantajları; –Bir takım genotipik ve fenotipik özellikleri in vivo hücrelerden farklıdır

33 Hücre Dizileri (‘Cell line’) •Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale getirilirler (viruslar, SMV40); –BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri) –16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri) •Kanserleşmiş hücreler kullanılır –A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri) NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection

34 A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri) (Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400) •DMEM, %10 FCS, 2mM L-glutamine •Tek katman (‘monolayer’) oluşturur

35 Dizel Egzoz Partikülleri DEP (medyan=0.4  m)

36 Hücre Canlılığı - MTT SF FCS % Dizel Egzoz Partikülleri (  g/ml)

37 DEP’nin A549 hücre canlılığı üzerine etkisi 24 saat ***p<  g/ml DEP 72 saat 48 saat

38 DEP (  g/ml) ile 72s İnkübasyonun A549’dan Sitokin Salınımına Etkisi

39 DEP (10  g/ml)’nin A549 hücre proliferasyonuna etkisi SF Bayram H et al, Eur Respir J 2006

40 SF *P<0.05 and **P<0.005 vs SF DEP (10  g/ml)’nin A549 hücre apoptozisine etkisi Bayram H et al, Eur Respir J 2006

41 DEP’nin A549 hücre p21 CIP1/WAF1 protein ekspresyonuna etkisi  -actin p21 CIP1/WAF1 10% FCS 10% FCS DEP (  g/ml) ** * *P<0.05 and **P<0.01 vs 0  g/ml DEP

42 *P<0.05 vs SF DEP (10  g/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549 hücre p21 CIP1/WAF1 mRNA ekspresyonuna etkisi

43 Sunu Akışı •Giriş; –Araştırma laboratuarı –Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? •Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri •Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Özet

44 Primer Hücreler -Avantajlar •İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik •Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler

45 Primer Hücre Kültürü- Dezavantajlar •Elde edilmeleri daha zor •Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar •Etik sorunlar

46 Doku - Hücre Kaynağı •Cerrahi eksplant –Pnömonektomi, Lobektomi –Transplant akciğeri •Biyopsi •Fırçalama (epitel hücreler) •Enzimatik digestion, •Disseksiyon •Hazır, ticari olarak

47 Akciğerin Primer Hücre Kültürleri •Düz kas hücreleri •Fibroblast kültürleri •Alveolar epitel hücreleri •Bronş epitel hücreleri

48 Hava Yolu Düz Kas Hücreleri

49 Hava Yolu Fibroblast Kültürleri

50 Alveol epitel Hücreleri ( Tip I ) Alveol epitel Hücreleri ( TipII ) Bazal membran Alveol Epitel Hücre Kültürleri

51 Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri •Fırçalama, •Enzimatik digestion, •Disseksiyon

52 Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu

53 Kültür Vasatı •‘Medium 199’ –Foetal bovine serum (2.5ml) –1ml bovine pancreatic insulin (2.5  g/ml) –1ml human transferrin (2.5  g/ml) –1ml epidermal growth factor (20  g/ml) –1ml hydrocortisone (0.36  g/ml) –1ml L-glutamine (0.02mg/ml) –1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon •100ml tamamlanır ve 0.2  m por çap filtreden geçirilir

54 Kültür Kapları 6cm çaplı, Falcon ‘Primaria ® ’’ plastik kültür kapı (Becton Dickinson,UK) 9mm çaplı 24 gözlü, 0.45  m por çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı

55 24-Kuyucuklu Plate

56 (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300) 1. Hafta 3. Hafta

57 Hücrelerin Elektron Mikroskobik Görünümü S M S D D x30,000 x56,000 M

58 Hücrelerin DEP ile İnkübasyon

59 Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi

60 Bayram H, et al. Am J Respir Cell Mol Biol DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi

61 Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı IL-8 GM-CSF RANTES sICAM-1 p <0.05 p<0.002 p<0.003 pg/  g selüler protein YK Non-ast.Ast. (log.) Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.

62 İn vitro Ozon –NO 2 Maruziyet Düzeneği %5 CO 2 İn Air NO 2

63 Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği

64 Ozon ve NO 2 ’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronş epitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.

65 Sunu Akışı •Giriş; –Araştırma laboratuarı –Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? •Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri •Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı •Özet

66 Özet •Bir araştırma laboratuarı kurmakla başlanmalı •İn vitro yöntemler çok çeşitli araştırmalarda kullanılabilirler •Akciğer hücre dizi ve primer hücre kültürleri yapılabilir •Solunum yolu hücrelerinin –Fizyolojik –Biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi –Çeşitli patolojilerdeki rollerinin aydınlatılmasında kullanılabilir

67 Yorum •Bütün dünyada yaygın olarak kullanılan in vitro araştırma yöntemlerinden yararlanmalıyız

68 TEŞEKKÜR St Bartholomew’s Hospital •Prof RJ Davies •Dr JL Devalia •RJ Sapsford •Dr OA Khair •Dr MA Abdelaziz •Dr C Rusznak Japonya •Dr M Sagai •Dr T Ohtoshi •Dr Y Miyabara •Dr H Takena NHLI-Imperial College •Prof KF Chung •Dr K Ito •Dr R Issa •Prof PJ Barnes Dicle Üniversitesi European Respiratory Society

69 TEŞEKKÜR Gaziantep Üniversitesi •Prof. Dr. Erhan Ekinci •Doç. Dr. Öner Dikensoy •Biol. Bülent Göğebakan

70 Sabrınız İçin Teşekkür Ederim


"IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: Toraks 11.Yıllık." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları