Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Hücre Kültürlerinde Rekombinant Protein Üretimi Feyza Tufan Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Fen Bilimleri Enstitüsü İstanbul Üniversitesi.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "Hücre Kültürlerinde Rekombinant Protein Üretimi Feyza Tufan Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Fen Bilimleri Enstitüsü İstanbul Üniversitesi."— Sunum transkripti:

1 Hücre Kültürlerinde Rekombinant Protein Üretimi Feyza Tufan Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Fen Bilimleri Enstitüsü İstanbul Üniversitesi

2 2 Bitki Hücre Kültürü İn vitro bitki kültürüyle üretilen iki ana tip ürün vardır: Sekonder metabolit: Ticari olarak bulunanlar; ginseng saponin, shikonin, berberine, paclitaxel (taxol) v.s. Rekombinant protein: Bitki hücre metabolizması, moleküler biyoloji ve fizyoloji alanındaki ilerlemeler. Antikorlar, single chain variable fragmentler (scFv), antijenler, aşılar, hormonlar, büyüme faktörleri, insan kan proteinleri, endüstriyel enzimler v.s. –Günümüzde, bitki temelli terapötik proteinlerin üretiminde 300'den fazla çalışma bulunmakta Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

3 3 Rekombinant Protein Üretimi Transgenik bitki hücre süspansiyon kültürleri kullanılarak rekombinant insan serum albumin ve kloramfenikolasetiltransferaz (CAT) üretimi Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

4 4 Rekombinant protein üretiminde, bitki temelli üretim sistemlerinin kullanılmasının önemli üstünlükleri: Yüksek derecede gelişmiş ökaryotik sistem Post-translasyonel modifikasyonların gerçekleşmesi Düşük maaliyetli üretim Güvenilirlik Etik problem bulunmaması Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

5 5 Bitki temelli üretim sistemlerinin olumsuz yönleri: Bitkilerde sentezlenen N-glikan yapısının memelilerle aynı olmaması Yavaş büyüme oranı Düşük protein üretim seviyeleri Somaklonal varyasyon Biyokimyasal ve genetik kararsızlık Kapasiteyi artırmadaki zorluklar Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

6 6 Rekombinant protein üretiminde, transgenik bitki hücre kültür sistemlerinin ideal özellikleri: Yüksek büyüme oranı Kolay transforme edilebilmesi Yüksek protein anlatım yeteneği Düşük endojen proteolitik aktivite Sekonder metabolitlerin düşük üretimi Post-translasyonel modifikasyon yeteneği Doğru ve düzgün glikolizasyon modeli ve doğru protein katlanması Biyoreaktörde küçük kümeleşme ve iyi homojen dağılma Hücre hattında uzun süreli genetik kararlılık Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

7 7 Konak anlatım sistemlerinin karşılaştırılması Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

8 8 In vitro Bitki Materyalleri Fonksiyonel proteinlerin üretiminde kullanılma potansiyeli olan 3 ana tip in vitro bitki materyali vardır: –Süspansiyon hücreleri –Saçak kök –Shooty teratomalar Çoğunlukla hücre süspansiyon kültürleri kullanılmakta Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

9 9 Transgenik bitki doku kültürlerinde yabancı protein birikmesi ve kararlılığı Tütün bitkisinde, murin IgG monoklonal antikorunu eksprese etmek için A. tumefaciens aracılı transformasyon gerçekleştirildi. Süspansiyon hücreleri, saçak kök ve shooty teratoma kültürleri transgenik bitki tohumlarından başlatıldı. Shooty teratomanın bulunduğu besiyerinde hemen hemen hiç antikor bulunmadı. Aynı zamanda sıvı kültürde morfolojik kararsızlık gözlendi. Süspansiyon hücrelerinin hızlı büyüdüğü gözlendi ve besiyerinde yüksek miktarda antikor birikti. Süspansiyon hücreleri morfolojik olarak kararlı olmasına karşın kültür süresinin uzamasıyla antikor seviyeleri azaldı. Buna karşın saçak köklerde miktar sürekliliği vardı. Ancak en yavaş büyüyen saçak köklerdi. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

10 10 Kültür tipleri Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

11 11 Hücre Süspansiyon Kültürleri Bitki süspansiyon hücreleri, sıvı besiyeri içerisine kolay dağılan (friable) kallus parçalarının aktarımı ve çalkalayıcı veya biyoreaktörlerde çalkalanmasıyla elde edilmekte GMP (Good Manufacturing Practice)’ye çok uygun Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

12 12 Hücre Süspansiyon Kültürleri Bitki hücre kültürleri kullanılarak geniş kapasiteli üretim işlemlerinin başarılı bir şekilde geliştirilmesinde biyoreaktör tasarımı ve işletimi önemlidir. Birkaç farklı reaktör tipleri bulunmaktadır (Stirred-tank bioreactor, pneumatic bioreactor, wave bioreactor, membrane bioreactor, miniature (scaled-down) bioreactor v.s.). Biyoreaktörlerde gerçekleştirilen in vitro bitki doku kültürü birçok üstünlük sağlamaktadır (Özellikle düşük hacimli, yüksek kalitede proteinlerin sentezinde). Rekombinant protein üretiminde bitki hücre kültürü uygulamaları, büyük oranda kullanılan hücre hattına ve ilgili ürüne bağlıdır. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

13 13 Hücre Süspansiyon Kültürleri N. tabacum cv NT-1 N. tabacum cv BY-2 N. tabacum L. cv Havana SR N. tabacum cv Xanthi N. benthamiana Oryza sativa Lycopersicon esculentum cv Seokwang Glycine max Anchusa officinalis Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

14 14 Hücre Süspansiyon Kültürleri Tütün Nicotiana tabacum cv BY-2 hücre kültüründe human interferon α2b (IFNα 2) üretimi (28 mg/L) Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

15 15 Hücre Süspansiyon Kültürleri Pirinç Kararlı transforme edilen yaklaşık 1000 kallus partikül bombardımanıyla üretildi. Kanda en çok bulunan proteaz inhibitörü olan, İnsan α-1 antitripsin (AAT), pirinç embriyonik doku süspansiyon hücre kültüründe üretildi. RAmy3D promotörü (pirinç α-amilaz gen promotörü) kullanıldı ve oldukça yüksek protein verimi elde edildi (200 mg/L). Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

16 16 Hücre Süspansiyon Kültürleri Domates İnsan granülosit makrofaj koloni stimule edici faktör (hGM-CSF)’ü kodlayan tamamlayıcı DNA klonlandı ve Agrobacterium aracılı transformasyonla domatese aktarıldı. Nüklear genoma entegrasyon, Northern Blot analiziyle doğrulandı. Hücre süspansiyon kültürü, hGM-CSF ile transforme edilen transgenik domates bitkisinin yaprak-türevli kalluslarından kuruldu. Rekombinant hGM-CSF transgenik hücre kültürü yoluyla sentezlendi ve büyüme besiyerinde salgılandı (kültivasyondan 10 gün sonra 45 µg/L). Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

17 17 Hücre Süspansiyon Kültürleri Soya Soya süspansiyon hücre kültürleri, hepatit B yüzey antijeni (HBsAg) ekspresyonu için, A. tumefaciens aracılığıyla transforme edildi. Maksimum ekspresyon seviyesi 700 ng/g. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

18 18 N. tabacum cv Xanthi N. tabacum cv NT-1 Potato (var. Kufri Bahar) Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi Saçak Kök Kültürleri

19 19 Saçak Kök Kültürleri Tütün Tütün saçak kök kültürlerinde, fare interlökin-12’nin üretiminde shake flasklar, airlift reaktör ve scalable mist reaktörününün karşılaştırılması Shake flasklarda üretilen kültürler yoluyla toplam mIL-12'nin yaklaşık %21'i besiyerinden geri kazanıldı (434µg/L). Airlift reaktöründe elde edilen kökler düzgün dağılmamıştı. Kök kalitesi diğerlerinde daha iyiydi. Besiyerindeki proteaz aktivitesi 3 sistemde de kültür boyunca sürekli arttı. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

20 20 Saçak Kök Kültürleri Patates Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi HBsAg'nin patates saçak köklerinde ekspresyonuyla ilgili ilk rapor Hepatit B yüzey antijeni için (HBsAg) iki farklı ekspresyon kasedi kullanılarak transgenik patates bitkisi geliştirildi. Kararlı transformasyon Southern analiziyle doğrulandı. Patates bitkisi, mikrotuber ve saçak köklerde sırasıyla 19,11, 23,194 ve 97,1 ng/g F.W. ekspresyon sağlandı. in vitro büyüyen bitkilerin internodal segmentleri, hepatit B virüsünün iki bitki ekspresyon vektörü pEFEHBS/pEFEHER taşıyan A. tumefaciens ile transforme edildi.

21 21 Saçak Kök Kültürleri Patates Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi Transgenik patates bitkisinin inter-nodal segmentlerinden saçak kök indüksiyonu

22 22 Su Mercimeği (Duckweed, Lemna) Lemnaceae; Monokot bitki ailesi Lemna ve Spirodela’yı kapsayan yeni geliştirilen alternatif eskpresyon sistemi (Rekombinant protein ve diğer moleküllerin üretilmesinde ilgi çekici bir sistem) Küçük, yenilebilir su bitkisi Güvenli, hızlı büyüyen, yetiştirmesi ve toplanması kolay ve yüksek protein içeriğine sahip (kuru ağırlığının %45’ine kadar) bir bitki Agrobacterium tumefaciens aracılı transformasyonla kolaylıkla kararlı transformasyonu gerçekleşmekte Şimdiye kadar bu sistemle 20’den fazla terapötik protein (antikorlar, aprotinin, büyüme hormonu, alfa interferon ve fab fragmentleri) eksprese edildi. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

23 23 Su Mercimeği Aprotinin, insan sağlığında kullanılan küçük bir serin proteaz inhibitörüdür. Spirodela, Agrobacterium aracılığıyla transforme edildi. 25 transgenik hat üretildi ve aprotinin üretimi Northern ve Western Blot analizleriyle doğrulandı (Ekspresyon seviyeleri 0.65 mg/L’ydi). Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

24 24 Su Mercimeği Transgenik Lemna minor 8627 bitkisinde, Acidothermus cellulolyticus endoglukanaz E1 sitozolik olarak eksprese edildi. Eksprese edilen enzim biyolojik olarak aktifti ve ekspresyon seviyesi toplam çözünebilir proteinin %0.24'üydü. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

25 25 Su Mercimeği Kararlı olarak transforme edilen Spirodela oligorrhiza SP bitkileri, Agrobacterium tumefaciens ile rejeneratif kallusların ko-kültivasyonunu takiben elde edildi. GFP aktivitesi, farklı etiketleme dizileriyle ilişkili olarak bitkinin farklı subsellüler kompartımanlarında gözlendi. Transgenik hatlar yaklaşık 18 aylık bir sürede ve 180 generasyonda izlendi. Hatlar morfolojik, büyüme oranı ve transgen ekspresyonu olarak kararlıydı. GFP ekspresyon seviyesi TSP’nin %25’iydi. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

26 26 Kara Yosunu (Moss) Yüksek bitkilerin dışında, yeni bitki üretim sistemi Birçok farmasötik proteinin başarılı olarak üretilmesinde (human VEGF- Vascular endothelial growth factor B v.s. ) kültüre alınabilir. Yüksek bitkiler gibi memeli proteinlerinin post- translasyonel modifikasyonlarını gerçekleştirmekte Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

27 27 Kara Yosunu Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi Yüksek derecede glikozillenmiş peptid hormonu eritropoietin (EPO) eritrosit olgunlaştırılmasının düzenlenmesinde ana rol oynamaktadır. Günümüzde memeli kültürlerinde rekombinant teknolojiyle EPO üretilip satılmaktadır. İnsan EPO (hEPO) cDNA'sı, Physcomitrella patens yabani tipi ve Δ -fuc-t Δ -xyl-t mutantında geçici ve kararlı olarak eksprese edildi. Protoplastlarda geçici ekspresyon yaklaşık 0,5 μg/L seviyelerinde eksprese edildi. 5 ve 10 L fotobiyoreaktör kültürlerinde, salgılanan rhEPO, 6 gün sonra yaklaşık 250 μg/g kuru ağırlığındaydı.

28 28 Endüstriyel Uygulamalar Yaklaşık 30 yıldır, önemli çabalar olmasına karşın, in vitro bitki kültürü yoluyla üretilen birkaç ürün ticarileştirilmiştir. Kültür yöntemleri ve metabolik biyokimyadaki bazı yeni gelişmeler bitki hücre kültürlerinin kullanım potansiyelini artırmıştır. Biyofarmasötiklerin üretimi için geliştirilen bitki hücre kültürünün uygulanabilirliği çok sayıda çalışmada kanıtlanmasına karşın sadece çok az sayıda örnek ticari olarak geliştirilmiştir. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

29 29 Endüstriyel Uygulamalar Şubat 2006’da USDA (United States Department of Agriculture) ilk kez, transgenik tütün hücre kültüründe üretilen rekombinant aşıyı onaylandı. –Kümes hayvanlarında görülen NDV hastalığına (Newcastle Disease Virus) karşı, tütün hücre kültüründe, NDV’nin immün koruyucu (immunoprotective) partiküllerinden türetilen HN (hemagglutinin/neuraminidase) antijenine dayalı rekombinant glikoprotein üretimi Dow AgroSciences tarafından geliştirildi. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

30 30 Endüstriyel Uygulamalar Transgenik tütün, patates veya domates hücre kültürlerinde, immunojenik proteinlerin üretiminde diğer başarılı örnekler: –Avian influenza virus (AIV)’ünün HA antijeni (hemagglutinin protein) –Infectious Bursal Diseases virus (IBDV)’ünün VP2 yapısal proteini Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

31 31 Protalix Biotherapeutics tarafından; Gaucher hastalığının tedavisi için bitki hücresi tarafından anlatım yapan rekombinant glukoserebrozidaz enzimi (GCD) üretimi Eylül 2009’da Faz III denemeleri tamamlandı. Glukoserebrozidaz’ın üretimi için süspansiyon kültüründe transgenik havuç hücrelerini süspansiyonu geliştirildi. Maaliyeti yılda yaklaşık $250,000 Endüstriyel Uygulamalar Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

32 32 Endüstriyel Uygulamalar Phyton Biotech, ticari olarak, bitki hücre süspansiyon kültürü kullanarak antikanser sekonder metabolit olan paclitaxel’i üretmekte Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

33 33 Biyoreaktörlerde, transgenik bitki hücre kültürlerinin tüm bitki sistemine göre üstünlükleri: -Ürün izolasyonu ve saflaştırma işlemlerinin çok daha basit olması -Kontrollü çevresel şartlar altında sağlanan ürün kalitesi ve homojenitesi -GMP gerekliliklerine uygun olması -Biyoreaktörlerde kontrollü koşullar altında üretilebilimesi -Transgen geçişi ile ilişkili çevresel kaygılar yok -Kısa büyüme döngüleri Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

34 34 Tüm bitki sistemi kullanılmasına göre olumsuzlukları: Bitki depo organlarıyla karşılaştırıldığında nispeten düşük protein verimi Kültür besiyerine salgılanan proteinlerin degredasyonu Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

35 35 Tüm bitki sistemi kullanımının olumsuzlukları: Tarla bitkilerinde, tarım ilaçları ve gübrelemekten kaynaklanan kontaminasyon ihtimali Değişken kültivasyon koşulları (hava, toprak içeriği, diğer organizmalarla etkileşim) Çevrede transgenik ekinin etkisi- transgen kaçışı ihtimali- rekombinant ürünle çevresel kontaminasyon Transgenik bitki üretimi daha fazla zaman gerektirmekte Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

36 36 Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

37 37 Gelecek yaklaşımlar Rekombinant protein verimi ve kalitesini geliştirmek için yapılması gerekenler: Hücre mühendisliği ve sistem biyolojisi yaklaşımları yoluyla son derece verimli hücre hatlarının geliştirilmesi Salgılanan rekombinant proteinlerin kararlılığını artırmak ve proteolitik degradasyonu önlemek Uyarılabilir bitki hücre kültürü sistemlerinin optimizasyonu ve biyoreaktör işletimiyle ilgili stratejiler Gen sessizleştirme baskılayıcılarının araştırılması İnsanlaştırılan bitki-yapımlı glikozillenmiş proteinlerin mühendisliği Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

38 38 KAYNAKLAR HELLWIG, S., DROSSARD, J., TWYMAN, R., FISCHER, R., 2004, Plant cell cultures for the production of recombinant proteins, Nature Biotechnology, 22 (11), HUANG, T.K., MCDONALD, K.A., 2009, Bioreactor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures, Biochemical Engineering Journal, 45, SHIH, S.M.H., DORAN, P.M., 2009, Foreign protein production using plant cell and organ cultures: Advantages and limitations, Biotechnology Advances, 27, DESAI, P.N., SHRIVASTAVA, N., PADH, H., 2010, Production of heterologous proteins in plants: Strategies for optimal expression, Biotechnology Advances, 28, WEATHERS, P.J., TOWLER, M.J., XU, J., 2010, Bench to batch: advances in plant cell culture for producing useful products, Applied Microbiology and Biotechnology, 85, Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi

39 39 TEŞEKKÜR EDERİM. Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi


"Hücre Kültürlerinde Rekombinant Protein Üretimi Feyza Tufan Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Fen Bilimleri Enstitüsü İstanbul Üniversitesi." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları