Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

Sunum yükleniyor. Lütfen bekleyiniz

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI 10. Ders Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR.

Benzer bir sunumlar


... konulu sunumlar: "MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI 10. Ders Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR."— Sunum transkripti:

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI 10. Ders Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR

2 PROTEİN SAFLAŞTIRMA YAKLAŞIMLARI Proteinler dışındaki tüm moleküller karışımdan uzaklaştırılır. (Örneğin, ham özüte streptomisin sülfat eklenerek DNA çöktürülür. Daha sonra da santrifüjleme ile uzaklaştırılır.) Proteinler çöktürülür. (TCA-NH 4 sülfat-organik çözücüler kullanılarak çöktürülen proteinler santrifüjlemeyle ayrılır.)

3 PROTEİNLER çoğunlukla Büyüklük ve şekil, Toplam yük, Yüzeyde bulunan hidrofobik gruplar, Kullanılan durağan faza bağlanma kapasitesi gibi özelliklerinin farklı olmasına dayanarak KROMATOGRAFİK YÖNTEMLERLE ayrılıp saflaştırılabilir.

4 KROMATOGRAFİ YunancaYunanca chroma ("color") ve graphein ("to write") kelimelerinden türetilmiş, kelime anlamı "renkli yazmak" olan kromatografi terimi, ilk kez Rus Botanikçi Mikhail Tsweet tarafından 1906’da kullanılmıştır. Kromatografi, bir karışımdaki çeşitli maddeleri, maddelerin özelliklerindeki farklılıklara dayalı olarak ayıran analitik tekniktir.

5 Katı veya sıvı bir durağan ( ʺ stationary ʺ ) fazın yüzeyine veya içine uygulanmış bir karışımdaki moleküllerin, sıvı veya gaz halindeki bir hareketli ( ʺ mobile ʺ ) faz aracılığıyla hareket ederken birbirinden ayrılmaları temeline dayanır. KROMATOGRAFİ

6 Bu ayrılmaya yol açan etkenler: Bu ayrılmaya yol açan etkenler: Moleküllerin Tutunma ( ʺ adsorption ʺ ) özelliği Dağılma ( ʺ partition ʺ ) özelliği İyon değişimi özelliği İlgi (afinite) özelliği Ağırlıklarındaki farklılıklar

7 Kolon kromatografisi, kolon dolgu maddesi (durağan faz, matris) ile doldurulmuş alttan musluklu basit bir cam boruda gerçekleştirilebilir. Protein karışımı uygun bir elüsyon çözeltisiyle kolonda sürüklenir. Durağan fazla etkileşim (adsorbsiyon) ve kolondan ayrılma (dezorbsiyon) özelliği bakımından farklı proteinler belli zaman aralıklarında veya hacimlerde toplanarak farklı fraksiyonlara ayrılır.

8 Elüsyon tamponu (Düşük-tuz) Elüsyon tamponu (Yüksek-tuz) Örnek karışımı Kromatografi kolonu Sırayla toplanan fraksiyonlar Fraksiyon sayısı veya akış hacmi Protein konsantrasyonu Yüksek-tuzDüşük-tuz

9

10 Absorpsiyon bir akışkanın başka bir sıvı veya katı cisim (emici madde) tarafından soğurulması işlemidir. Adsorpsiyon ise bir maddedeki (gaz veya sıvı da olabilir) atom, iyon veya moleküllerin emici maddenin yüzeyine yapışması, tutunması işlemidir.

11

12 Kolondan çıkan fraksiyonların otomatik olarak belli hacimlerde toplandığı ve absorbsiyonlarının ölçüldüğü sistemler de vardır. Böyle bir sistemde elüsyon çözeltisi rezervuarla kolona gönderilebileceği gibi, peristaltik pompa ile sürekli de beslenebilir. Kolondan geçen farklı fraksiyonlar fraksiyon kollektörü tarafından ayrı kaplarda toplanır ve absorbsiyonları belirlenebilir ya da enzim aktivitesi ölçülerek izlenebilir.

13 Kolon kromatografisinin farklı temellere dayanan çeşitli tipleri vardır: Elektrik yükü veya hidrofobik grupların dağılımı gibi bazı yapısal özelliklere dayanan: iyon değişimi kromatografisi, iyon değişimi kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografisi, metal-kelat kromatografisi Protein ve dolgu maddesi arasındaki yapısal ve işlevsel uyum ve etkileşim temeline dayanan: afinite kromatografisi (lektin afinite kromatografisi, immünopürifikasyon) Molekül boyutuna dayanan: jel geçirgenlik kromatografisi (jel filtrasyonu veya moleküler elek tekniği)

14 Proteinleri oluşturan amino asitler farklı yan zincirlere sahiptir. Aspartik ve glutamik asit pH 7.0 değerinde negatif yüklü asidik gruplar taşırken; lizin, arjinin ve histidin pozitif yüklü bazik gruplar içerir.

15

16 arginin lizin histidin aspartik asitglutamik asit

17 Her protein, bu beş amino asiti farklı oranlarda içerdiğinden, moleküllerin yükleri de farklı (pozitif veya negatif) olur. Proteinin net yükü yapısındaki bu amino asitlerin miktarına ve protein çözeltisinin pH’sına bağlı olarak değişir. Proteinler toplam yüklerinin 0 olduğu pH değerinin (izoelektirik nokta, pI) üzerindeki pH değerlerinde negatif, altındaki pH değerlerinde ise pozitif elektrik yüküne sahiptir.

18 elektrostatik etkileşimler İyon değişimi kromatografisinin temelini, proteinin yüklü grupları ile katı matriks arasındaki elektrostatik etkileşimler oluşturmaktadır.

19 ANYON DEĞİŞTİRİCİLER KATYON DEĞİŞTİRİCİLER + yüklü iyon değiştirici matrisler ANYON DEĞİŞTİRİCİLER, - yüklü iyon değiştirici matrisler KATYON DEĞİŞTİRİCİLER

20 Proteinler, ya kullanılan tampon çözeltisinin pH’sının ya da tuz konsantrasyonunun değiştirilmesi ile kolondan ayrılırlar.

21 Bir anyon değiştiricide negatif yüklü proteinlerin ayrılması: Kolon ayırımı yapılacak proteinle zıt yükte olan dolgu maddesi (matriks) ile doldurulur. (a) Pozitif ve negatif yüklü proteinlerden oluşan karışım kolona yüklenir. Zıt yüke sahip proteinler kolon dolgu maddesine adsorbe olurken, matriksle aynı yükte olanlar kolonu terk ederler. (b) Kolon içinde tutulmuş proteinlerin ayrılması için, kolon NaCl çözeltisi ile yıkanır. Tuz iyonları (karşıt iyonlar, "counter ions") matriks yüzeyindeki yüklü gruplarla rekabet ederek ilgili proteinin kolondan ayrılmasına yol açarlar. Tuz konsantrasyonunun kademeli olarak artırılması ile, daha fazla yüke sahip proteinlerin de kolonu terk etmesi sağlanır. a)b) NaCl

22

23

24 GENEL ANYON DEĞİŞTİRİCİLER’ GENEL ANYON DEĞİŞTİRİCİLER’ de yer alan + yüklü gruplar: Aminoetil C 2 H 4 N + H 3 Dietilaminoetil C 2 H 4 NH + (C 2 H 5 ) 2 Trietilaminoetil C 2 H 4 N + (C 2 H 5 ) 3 GENEL KATYON DEĞİŞTİRİCİLER’ GENEL KATYON DEĞİŞTİRİCİLER’ de yer alan - yüklü gruplar: Sülfo SO 3 - Karboksimetil CH 2 COO -

25 Anyon değiştirici mi, katyon değiştirici mi seçmeliyiz? Ayırmak istediğimiz proteinin pH stabilitesi önem taşır. pI değerinin üzerindeki pH değerlerinde mi (yani – yüklü olduğu durumda) daha kararlı, yoksa pI değerinin altındaki pH değerlerinde mi (yani + yüklü olduğu durumda) daha kararlı? Hangisinde daha kararlı ve dayanıklı ise onu seçmeliyiz.

26 selüloz, agaroz ve dekstranın karboksimetil (CM) dietilaminoetil (DEAE) pH 4-9’un dışındaki pH değerlerinde stabilitesini koruyan protein sayısı azdır. Onun için adsorban sayısı sınırlıdır. En çok kullanılan adsorbanlar selüloz, agaroz ve dekstranın karboksimetil (CM) ve dietilaminoetil (DEAE) türevleridir.

27 Tablo 2. Proteinlerin ayrılmasında kullanılan iyon değişimi matriksleri a,b. Anyon değiştirici matriksler Anyon değiştirme kapasitesi Katyon değiştirici matrikslerKatyon değiştirme kapasitesi Polistiren AG 1KuvvetliAG 50WKuvvetli AG 2KuvvetliBio-Rex 70Zayıf Bio-Rex 5Orta AG 3-X4AKuvvetli Bio-Rex MSZ 1-X8Kuvvetli Sellüloz Aminoetil sellülozZayıfCM-sellülozZayıf DEAE-sellülozZayıf Benzil DEAE-sellülozZayıf ECTEOLA-sellülozZayıf PEI-sellülozZayıf QAE-sellülozKuvvetli TEAE-sellülozZayıf DEAE-sepasel (sephacel)Zayıf

28 Anyon değiştirici matriksler Anyon değiştirme kapasitesi Katyon değiştirici matriksler Katyon değiştirme kapasitesi Sefadeks (sephadex) Dekstran esaslı matrikslerdir. DEAE-sefadeks (A-25 veya A-50) ZayıfCM-sefadeks (C-25 veya C-50) Zayıf QAE-sefadeks (A-25 veya A-50) KuvvetliSP-sefadeks (C-25 veya C-50) Kuvvetli Sefaroz (sepharose) Agaroz esaslı matrikslerdir. DEAE-sefaroz CL-6B ZayıfCM-sefaroz CL-6B Zayıf DEAE-sefaroz (hızlı akışlı) ZayıfCM-sefaroz (hızlı akışlı) Zayıf Q sefaroz (hızlı akışlı) KuvvetliS sefaroz (hızlı akışlı) Kuvvetli a Kısaltmalar: CM, karboksimetil; DEAE, dietilaminoetil; ECTEOLA, epiklorohidrin trietanolamin; PEI, polietilenimin; Q, kuaterner amin; QAE, dietil-  2- hidroksipropil  -aminoetil; S, sülfonat; SP, sülfopropil; TEAE, trietilaminoetil. bSephadex, Sephacel ve Sepharose Pharmacia tarafından üretilmektedir. Sellülozun çeşitli türevleri Whatman, Sigma ve diğer bazı üretici firmalardan da sağlanabilir. AG ve Bio-Rex Bio-Rad firması tarafından üretilen polistiren esaslı matrikslerdir. Başka firmalar da benzer maddeler üretmektedirler (örneğin, Dow ("Dovex"), Rohm ve Haas ("Amberlite") gibi.

29 Por özelliği önemli mi? EVET Çünkü bağlama kapasitesi etkilenir MW proteinler için DEAE-Sephacel veya –Sepharose; Daha büyük proteinler için Sephadex A-25 veya C-25 kullanılır.

30 hareketli faz daima tamponlanır Donnan etkisi İyon değişimi kromatografisinde hareketli faz daima tamponlanır. Tamponlanmayan çözeltiler, proteinler yerine, anyon değiştiricilerin yüzeyinde OH  ve katyon değiştiricilerin yüzeyinde H + iyonlarının lokalize olmasına (Donnan etkisi) yol açar. Bu da olumsuz iyon değişimlerine ve protein denatürasyonuna neden olur.

31 Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu hidrofobik etkileşimlerden yararlanılır. Bu etkileşimin derecesine göre farklı proteinler farklı zamanlarda kolonu terk ederler.

32 Sabit fazdaki hidrofobik ligantlara örnekler Örnek, yüksek derişimde tuz içeren (not: denatürasyona yol açmayacak türden olmalı, örneğin amonyum sülfat) bir tamponda çözündürülerek kolona yüklenir. Proteinler tampondaki tuz konsantrasyonu azaltılarak kolondan ayrılır.

33 Tuz konsantrasyonundaki artış hidrofobik etkileşimlerin güçlenmesine (ortaya çıkmasına) neden olur hidrofobik bölge hidrofilik bölgeler Düşük tuz Yüksek tuz konsantrasyonlarında hidrofobik etkileşimler meydana gelir. Hidrofobik bölgelerin agregat oluşturma eğilimi fazladır.

34 Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu metal komplekslerinden yararlanılır.

35 Örneğin, İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi (IMAC) Bu teknik, Psödoafinite (Yalancı İlgi) teknikleri olarak da adlandırılan bir gup teknik içinde ele alınmaktadır. Bu grubun diğer örnekleri ise: Tiyofilik Adsorpsiyon Kromatografisi (TAC)dir. Boya Ligand Kromatografisidir.

36 Bu yöntem biyolojik etkileşim temeline dayanır ve bu nedenle son derece özgül ayırımların yapılabilmesini sağlar.

37 A (makromolekül) + B (ligand) A:B biyolojik yanıt ligandBu teknikte proteinler ligand adı verilen maddelere geri dönüşümlü olarak bağlanırlar. Ligandlar, aktif taşıyıcıya kovalent olarak bağlanan ve saflaştırılacak makromoleküle özel ve seçimli afinite gösteren küçük moleküllerdir. Örneğin, antikor, bir enzimin inhibitörü, kofaktörü ve özel hallerde substratı olabilir. Birçok ligand önce inert destek metaryaline bağlanır ve kromatografi kolonuna paketlenir. Bu sistemde sadece istenilen protein kolondaki liganda bağlanır. Diğer proteinler bağlanmadan ayrılır. Daha sonra kolonun uygun bir tampon ile yıkanması sonucunda istenmeyen proteinler tamamen uzaklaştırılır. Bir sonraki adımda ise tamponun uygun bir şekilde değiştirilmesi ile liganda bağlanan protein kolondan geri kazanılır.

38

39

40 Yöntemin, ligand ile ayrılacak protein arasındaki etkileşimin tipine göre farklı uygulamaları vardır:

41 İmmobilize protein A veya İmmobilize protein G veya İmmobilize protein L içeren kolonda ANTİKOR saflaştırması yapılabilir.

42 I.Adım:İmmünoadsorban hazırlanır. Antijenler (mavi) katı matrise (pembe yuvarlaklar, selüloz, agaroz vb.) kovalent olarak bağlanır (İMMOBİLİZASYON). II.2. Adım: Protein karışımı (ör. Serum) kolondan geçirilir. Antijene afinitesi olan antikorlar (kırmızı) antijene kovalent olmayan etkileşimlerle bağlanır ve kolonu daha geç terkeder. III.3. Adım: Antijene tutunmuş antikoru kolondan ayırmak için elüsyon sıvısı (yüksek derişimde tuz içeren ve/veya düşük pH’da bir tampon) geçirilir. IV.4. Adım: Kolondan toplanan örneğin (elüent) dializ edilerek tuzlardan arındırılması gerekir.

43 Bu yöntemde proteinler molekül büyüklüklerinin farklı olması esasına göre ayrılırlar.

44 Kolon dolgu maddesi küresel yapılı ve belirli boyutta gözeneklere sahip inert jel parçacıklarından oluşmuştur. Farklı boyutta molekülleri içeren bir çözelti kolondan geçirildiğinde, büyük moleküller gözenekli taneciklerin aralarındaki boşluklardan geçerek kolonda hızla ilerlerler; gözenek boyutlarından küçük moleküller ise gözenek içerisine diffüzlenir ve molekül küçüldükçe artan bir alıkonma süresi ile kolondan çıkarlar.

45

46 Jel geçirgenlik kromatografisinde kullanılabilecek matris materyallerinden örnekler. Ticari adıMatriks tipiÜreticipH aralığı Sıcaklık stabilitesi ( o C) SefadeksDekstranPharmacia2120 SefarozAgarozPharmacia4-940 Sefaroz CLÇapraz bağlı agaroz Pharmacia SefasirilDekstran/bisPharmacia Ultrogel AAgarozIBF4-940 Biogel AAgarozBio-Rad4-940 Biogel PPoliakrilamidBio-Rad

47

48 Amino asitler, karbohidratlar, lipidler, nükleik asitler, proteinler, pigmentler, streoidler ve diğer biyolojik aktif moleküllerin ayrılmasında ve tanımlanmasında çok iyi sonuçlar veren bu teknik temelde otomatik hale getirilmiş modern bir sıvı kromatografi tekniğidir.

49 HPLC’nin klasik sıvı kromatografilerine göre önemli üstünlükleri vardır: 1)Çözünme (ayrıştırma) ve analiz hızı klasik yöntemlerden çok yüksektir. 2)Kolonları yeniden doldurulmadan ve yenilenmeksizin sürekli kullanılabilir. 3)Ayırma gücünü etkileyen değişkenler sıkı şekilde kontrol edilebildiğinden tekrarlanabilirliği son derece yüksektir. 4)Aletin çalışması ve verilerin analizi kolaylıkla otomatikleştirilir. 5)Büyük boyuttaki (preparatif) ayırım süreçlerine uygulanabilir.

50 Kromatografik bir sistemde hareketli faz gaz, durağan faz da inert katı partiküller üzerini kaplayan bir sıvı olduğunda bu tekniğe gaz-sıvı kromatografisi ya da kısaca gaz kromatografisi (GC) denir.

51

52 Gaz kromatografisi temelde dağılım olayına dayanır. Durağan faz, yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı, paslanmaz çelik veya camdan bir tüp (kolon) içine doldurulur. İnert bir gaz (genelde helyum, azot veya argon) (hareketli faz) yüksek basınç altında kolondan geçirilir.

53 Çalışılan materyale ait örnek buharlaştırılarak gaz fazına sokulur ve durağan fazdan geçmesi sağlanır. Örnekteki bileşenler hareketli faz ile katı destek üzerindeki durağan sıvı faz arasında dağılırlar. Durağan faza ilgisi olan moleküllerin kolondaki hareketleri daha yavaş olur.

54 Gaz kromatografisi çok küçük moleküllerin son derece iyi ayrılmasını sağlayan; basit, çok yönlü, hızlı bir tekniktir ve çok duyarlıdır. Bununla birlikte, bu kromatografideki en önemli kısıtlama örneğin uçucu ve yüksek sıcaklık derecelerine ( o C) dayanıklı olması gerekliliğidir. Bu nedenle, gaz kromatografisi ancak uçucu ya da uçucu türevi hazırlanabilen moleküllerin ayırımında kullanılabilir.

55 Models : Agilent 7890A, 6890N, Thermo Trace GC Ultra Detector : Flame Ionisation Detector (FID) Columns available : DB 5, DB 35, DB 225, HP Chiral Analysis: Separation of volatile metabolites, pesticides, chiral compounds

56

57

58

59

60 Sonuç : Tüm proteinler için geçerli bir saflaştırma stratejisi yoktur !!! Hedef proteinin özelliklerine göre araştırmacı en uygun yöntemi uygulamalıdır.

61 F.Zihnioğlu (http://protein.ege.edu.tr/Konular/PROTEINsafla%FE.pdf)


"MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI 10. Ders Doç.Dr.Evren ÖNAY UÇAR." indir ppt

Benzer bir sunumlar


Google Reklamları