Mikrobiyoloji Laboratuvarı/

... konulu sunumlar: "Mikrobiyoloji Laboratuvarı/"— Sunum transkripti:

1 Mikrobiyoloji Laboratuvarı/
Gözden Kaçabilenler Prof. Dr. Kadir HALKMAN Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü 09 Nisan 2015; Merck Millipore, İstanbul

2 Aerobik Koloni Sayısı 01 Önceden Toplam Mezofili Aerobik Bakteri sayısı iken daha sonra Aerobik Koloni Sayısı olarak standartlarda yer aldı. Gerekçesi bazı mayaların da bu besiyerinde (PCA) ve aynı inkübasyon koşullarında gelişerek koloni oluşturabileceği idi. Gereksiz bir detaydır çünkü bu ifade analiz edilen numunede genel mikrobiyolojik kalite hakkında bilgi veren bir simgesel ifadedir. Bir numunede bütün bakterileri sayabilecek bir besiyeri yoktur ve olamaz. Bu nedenle sayım sonucu KOB (CFU) olarak ifade edilir. Üretim izni olanlara var

3 Koliform/ E. coli Analizleri 01
Enterobacteriaceae içinde koliform grup, yapay bir gruptur, taksonomik özelliği yoktur. 5 tür bakteri koliform grubu temsil eder: Escherichia coli; Enterobacter aerogenes; Ent. cloacae, Citrobacter freundii ve Klebsiella pnemoniae. Bunlardan E. coli her koşulda dışkı kökenlidir, fekal bulaşma indikatörüdür. Diğer 4 tür, bitki/ toprak ya da dışkı kökenli olabilir. Dışkı kökenli olanların tümü fekal koliform olarak tanımlanır.

4 Koliform/ E. coli Analizleri 02
Önceki ISO numaralı standartta kullanılan Lactose TTC Agar with sodium heptadecylsulfate besiyerinde E. coli, diğer koliform grup üyelerinden morfolojik olarak ayrılamaz. Bu besiyerinde gelişen bütün koliformlar, laktozdan asit oluşturur ve oluşan bu asitlik filtre altında sarı benek ile belirlenir. Koloni rengi, besiyeri bileşimindeki TTC’nin indirgenmesi ile ilişkilidir. Koliform grup TTC’yi zayıfça indirger ve koloni rengi turuncu olur. Laktoz negatif diğer bakteriler ise TTC’yi kuvvetli indirgeyerek kırmızı/ mor koloniler oluştururlar. E. coli dahil olmak üzere koliform grup bakteriler arasında TTC’yi indirgeme farkı yoktur. İnek için %89,7; koyun keçi için %10'dan fazla değerleri de var. 10 işçiden fazla büyük elektrik

5 Koliform/ E. coli Analizleri 03
Membran filtrasyon uygulamalarında fekal koliformlar için önerilen mFC besiyeri 44,5 oC yerine 37 oC’ta inkübe edilirse bütün koliformlar gelişir. Fekal koliformlar için 44,5 oC’ta inkübasyon gerekir. 37 oC’ta inkübe edilen besiyeri bileşiminde fekal olan ve olmayan koliformları ayıracak bir bileşen yoktur, Koliformlar arasında (E. coli dışında) fekal olan ve olmayanları ayırabilecek yegâne fark yükseltilmiş inkübasyon sıcaklığıdır. CCA

6 Koliform/ E. coli Analizleri 04
LST+MUG Broth besiyerinde inkübasyon sonrası floresan ışıma kesin değilse, tüpe 1 mL 1 N NaOH eklenip, karıştırılır ve tekrar kontrol edilir. Oluşan asitlik bazen floresan ışımayı maskeleyebilir, NaOH bu asitliği giderir. İndol testi de yapılacak ise, ilave edilen bu NaOH, test sonucunu etkilemez. İndol testi sonrası floresan ışıma testi yapılamaz.

7 Koliform/ E. coli Analizleri 05
E. coli dışındaki koliform grup üyesi 4 bakteri, bitki/ toprak kaynaklı olabileceği gibi dışkı kaynaklı da olabilir. Dışkı kökenli tüm koliformlar “Fekal Koliform” olarak tanımlanır. Bir numunede E. coli yok iken dışkı kökenli koliformlar olabilir. Dolayısı ile E. coli yerine fekal koliform aranması fekal kontaminasyon açısından daha doğru sonuç verir. Güncel uygulamada fekal koliform yerine E. coli analizinin yaygın olma nedeni, E. coli analizinin çok kolay olmasıdır.

8 Sporlu Bakteri Analizi 01
Mikrobiyoloji laboratuvarında en fazla sahte negatif sonuç alınan testlerdir. Numunede sporlu olmayanların elimine edilmesi için pastörizasyon uygulanır. Aynı bakterinin vejetatif formda olanları bu aşamada ölür. Bakteriler sadece hayatî bir tehlike varsa spor oluştururlar. Sporlu bakteri analiz sonucu, sadece analiz yapıldığı anda spor oluşumunu tamamlamış bakteri sayısını verir. Soğuk değil ama serinde (8-10 oC) depolanmış çiğ sütte sporlu Bacillus cereus analizi yapılırsa sonuç 0 çıkar çünkü bu sıcaklıkta tümü ya da tümüne çok yakını vejetatif formdadır.

9 Clostridium analizi 01 Clostridium spor analizinde 0,2 µm porlu membran filtreler kullanılır. Spor analizinde pastörizasyon gereklidir. Bu amaçla numune 755 oC’ta 15 dakika tutularak vejetatif hücrelerin ölmesi sağlanır. Pastörize edilip soğutulmuş numune filtre edilir. Pastörizasyon sırasında spor oluşumu tamamlanmış hücreler canlı kalır.

10 Staph. aureus Analizi 01 Baird-Parker Agar besiyerine yumurta sarısı tellurit emülsiyonu eklenir. MYP Agar ya da başka besiyeri katkısı olan yumurta sarısı eklenirse siyah renkli koloni elde edilemez (sahte negatif sonuç alınır). Baird-Parker Agar besiyerinde inkübasyondan sonra tipik zonlu, parlak siyah koloniler Staphylococcus aureus kolonileridir ancak bunların sayısı önemli değildir. Gıda standartları koagülaz pozitif olanlarla ilgilenir. İnkübasyondan önce ya da sonra Baird-Parker Agar besiyerinin bir gece buzdolabında tutulması ile daha berrak zon elde edilir.

11 Staphylococcus analizi 02
Staphylococcus ile koagülaz pozitif Staph. aureus kastedilmektedir. Baird-Parker Agar besiyerinde kolaylıkla belirlenebilir. Arıtılmış içme sularında bulunması beklenmez. Asıl olarak yüzme havuzlarında yüzücülerden kaynaklanan bulaşma söz konusu olabilir. Baird-Parker Agar üzerinde saydam zon yapan siyah renkli parlak koloniler Staph. aureus olarak tanımlansa bile yeterli değildir. Her koşulda koagülaz testi yapılarak patojen olup olmadığı saptanmalıdır.

12 Salmonella Analizi 01 Tamponlamış Peptonlu Su, Salmonella analizinde kullanılacaksa mutlaka 25,5 g/L olarak hazırlanmalıdır. Ön zenginleştirme 371oC’ta 18 2 saat süre ile yapılır. İnkübasyon süresi uzarsa refakatçi flora baskılaması nedeni ile sahte negatif sonuç alınabilir. ISO 6579 numaralı standarda göre Selektif zenginleştirme için RVS Broth ve MKTTn Broth kullanılmalıdır. Her ikisinin inokülüm miktarı ve inkübasyon sıcaklıkları farklıdır.

13 Salmonella Analizi 02 Selektif zenginleştirmeden sonra her 2 besiyerinden ayrı ayrı 2’şer selektif katı besiyerine sürme yapılır. Bunlardan biri XLD Agar’dır, diğeri kullanıcının tercihine bırakılmıştır. Tipik koloniler biyokimyasal ve serolojik testlerle doğrulanır. Tipik koloniler bir tüp içindeki saf suda iyice çözülür ve usulüne uygun olarak Singlepath Salmonella ile kontrol edilebilir. Bu amaçla çok sayıda koloni tek tüpe aktarılabilir.

14 Salmonella Analizi 03 Singlepath Salmonella, selektif zenginleştirme aşaması sonrası uygulanacak ise (laboratuvarın planlaması bu şekilde ise) hem RVS hem de MKTTn Broth kültürü kullanılmalıdır. Singlepath Salmonella test sonucu negatif ise daha fazla ilerlemeye gerek yoktur. Pozitif sonuçta geleneksel kültür yöntemleri ile devam edilmelidir.

15 Listeria monocytogenes Analizi 01
Salmonella analizinden farkı kullanılan besiyerleri, inkübasyon sıcaklık ve süreleridir. Selektif katı besiyeri olarak 2 farklı besiyeri kullanılır, bunlardan biri Listeria Selective Agar acc. to Ottaviani and Agosti iken diğer besiyeri kullanıcı tercihine bırakılmıştır. Singlepath L’ mono sadece Listeria monocytogenes sonucunu verir, diğer Listeria türleri bu test ile negatif sonuç gösterir. Koloni karışımına uygulanabilir. Selektif zenginleştirme aşamasında kullanılacaksa 1/1 Fraser zenginleştirme sonrası kullanılması önerilir.

16 Pseudomonas aeruginosa Analizi 01
Özellikle suların analizinde çok sıklıkla sahte pozitif sonuca rastlanmaktadır. Cetrimide Agar besiyerinde Ps. fluorescens ve Ps. aeruginosa aynı morfolojik görünümde koloni oluştururlar ve her ikisi de floresan ışıma verir. İnkübasyondan sonra tipik koloniye Asetamit testi uygulanmalıdır. Ps. aeruginosa pozitif, Ps. fluorescens negatif sonuç verir. Tipik koloni herhangi bir sıvı ya da katı genel besiyerine inoküle edilip 42 oC’ta 24 saat inkübe edilir. Ps. aeruginosa pozitif, Ps. fluorescens negatif sonuç verir.

17 Ps. aeruginosa Analizi 02 Cetrimide Agarın ekimden sonra doğrudan 42 oC’ta inkübasyonu da mümkündür. Ya da aynı numuneden 2 Cetrimide Agar besiyerine ekim, bunlardan birisinin 37 oC, diğerinin 42 oC’ta inkübasyonu da mümkündür ve muhtemelen analizin bu şekilde yapılması en akılcı çözümdür.

18 Şahit Testler 01 Laboratuvarda uygulanan her analiz için belirli süreler ile (ayda 1; 2 ayda 1 vb.) pozitif ve negatif şahitler ile biyokimyasal ve fizyolojik doğrulama testleri yapılmalıdır. Örneğin; Pseudomonas çalışan her laboratuvar asetamit testinde pozitif kontrol olarak Ps. aeruginosa ve negatif kontrol olarak Ps. fluorescens; 42 oC gelişme testinde yine pozitif kontrol olarak Ps. aeruginosa ve negatif kontrol olarak Ps. fluorescens ile kontrol yapmalıdır. Bu amaçla laboratuvarda Ps. aeruginosa ve Ps. fluorescens kültür koleksiyonunda bulunmalıdır.

19 Şahit Testler 02 Patojen analizi yapan laboratuvarlar belirli aralıklarla ilgili patojeni numuneye yapay olarak ekleyip analiz sonucunu pozitif olarak almalıdırlar. Çoğu işletme laboratuvarı, patojen bakterinin kültür koleksiyonunda bulunmasını ve yapay olarak gıdaya bulaştırılmasını güvenlik nedeni ile kabul etmez. Bu durumda Üniversite, Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Sağlık Bakanlığı, Belediye hatta özel laboratuvarlardan yardım alınmalıdır. Basit bir örnekle Listeria Selective Agar acc. to Ottaviani and Agosti besiyerinde L. monocytogenes kolonisi besiyeri üreten tüm firmaların kataloglarına göre çok tipiktir ancak ilgili laboratuvar personeli bunu Petri kutusunda görmelidir.

20 Şahit Testler 03 Her analizde şahit olarak 1 Petri kutusu ekilmeden inkübatöre konulmalıdır. Özellikle toplam bakteri ve maya-küf analizlerinde kullanılan Petri kutusu kapağı tam olarak açılmalı ve analiz boyunca bu şekilde tutulmalı ve açık kaldığı süre kaydedilip inkübatöre yerleştirilmelidir. Bu Petri kutusunda dakikada 1 koloni düşmesi normaldir, daha fazla koloni varsa laboratuvar havasının temizlenmesi için düzeltici faaliyet uygulanmalıdır (Ozon gazı, UV lamba vb.)

21 Şahit Testler 04 Yayma kültürel yöntemle analiz yapılıyorsa VRBL Agar gibi yeterince selektif besiyerlerine dahi, alkolden çıkartılmış Drigalski spatülü alevden geçirilmeden agarlı besiyerine sürülmeli ve inkübatöre bırakılmalıdır. Bu, kullanılan alkolün etkinlik testidir. Özet olarak her analizde ilgili 3 Petri kutusu kontrol olarak kullanılmalıdır: Ekim yapılmamış besiyeri (sterilizasyon kontrolü); analiz boyunca kapağı tam açık Petri kutusu (laboratuvar havası kontrolü) ve alkol yayılmış Petri kutusu (alkol etkinlik kontrolü).

22 Şahit Testler 05 Kullanılan otomatik pipetler pipet ucu takılmamış şekilde, analize başlanmadan önce alkolde 4-5 cm derinlik olacak şekilde 30 dk. tutulmalıdır. Çoğu uygulayıcı otomatik pipet kullanmada gereken özeni göstermemektedir ve hızlı çek/ boşalt sonunda pipetler kontamine olmaktadır. Drigalski spatülleri üzerinde film tabakasına dikkat. Bu spatüller kullanma sıklığına bağlı olarak belirli aralıklarla 1 gece boyunca çamaşır suyuna bırakılmalı, iyice durulanıp otoklavda 121 oC’ta 15 dk. sterilize edilmelidir.

23 Petri kutularının inkübasyonu 01
Pek çok kaynakta Petri kutusuna yerleştirilen membran filtrenin düşme olasılığına karşı tabanı üzerinde inkübasyon önerilir. EPA (US Environmental Protection Agency) ise Petri kutularının kapağı üzerinde inkübasyonunu önermektedir. Filtre, kapağa düşecek olursa koloni gelişmesi olmayacağı açıktır. Tabanı üzerinde inkübasyonun sakıncası ise su damlaların besiyeri/ filtre üzerine düşerek kolonilerde aşırı gelişmedir.

24 HGMF 01 Hydrophobic Grid Membrane Filter; ABD’de kullanılan özel bir membran filtrasyon sistemidir. 40x40 olmak üzere filtrasyon alanı 1600 kareden oluşur. Karelerin sınırında hidrofobik bir ızgara sistemi vardır. Filtrasyon sonunda hücre ızgara üzerinde kalamaz, her koşulda ya alttaki ya üstteki ya sağdaki ya da soldaki kareye geçer ve burada koloni oluşturur. İnkübasyon sonunda koloniler değil, pozitif kareler sayılır ve sonuç, özel bir formül ile hesaplanarak EMS olarak verilir.

25 HGMF 02 HGMF + YM11 Agar besiyeri ile 48 saat sonunda küf sayımı yapılabilir. Prensibi, küf kolonileri henüz çıplak gözle fark edilemeyecek kadar küçük olmasına rağmen metabolitlerin besiyerindeki bir indikatör aracılığı ile renk değişimi sağlamasıdır. 1600 karenin her birinin alanı yaklaşık 1,5 mm2 olup, metabolitler 48 saatlik inkübasyon sonunda bu alanda fark edilebilir renk değişikliği yapar. Tek başına YM11 Agar 48 saatte küf sayısını veremez.

26 Besiyerleri 01 Membran filtrasyon sisteminde kullanılan çok farklı yaklaşımlarla hazırlanmış besiyerleri vardır. Koloni elde edilmesi esas olduğuna göre katı besiyeri kullanılması gerekir. 3 ana grup vardır. -Filtre, önceden agarlı besiyeri dökülmüş Petri kutusu üzerine yerleştirilir. Bu besiyerleri, laboratuvarda hazırlanabileceği gibi hazır ticari formda da sağlanabilir. -Filtre, absorban pede besiyeri eklenmiş, kurutulmuş ve kullanma anında steril su ile ıslatılarak aktifleştirilen besiyeri üzerine yerleştirilir.

27 Besiyerleri 02 -Filtre, bir Petri kutusu içinde absorban pet bulunan ve kullanım anında steril sıvı besiyeri dökülerek aktifleştirilen besiyeri üzerine yerleştirilir. Bu besiyerleri, hazır ticari formda sağlanabileceği gibi steril boş Petri kutusu içinde steril pet sağlanarak laboratuvarda da hazırlanabilir. Bu 3 ana gruptan hangisinin seçileceği laboratuvarın kararıdır. Bu amaçla üretilmiş yerli ya da yabancı pek çok marka bulunmaktadır. Kaliteye dikkat edilmesi önceliklidir. Düşük fiyat, ucuz anlamına gelmez. Sayım tartışma

28 Kalibrasyon 01 .  Nokta

29 Ankara Üniv. Gıda Mühendisliği Bölümü
Teşekkürler, Sorularınız/ katkılarınız Prof. Dr. A Kadir Halkman Ankara Üniv. Gıda Mühendisliği Bölümü