ENZİM KİNETİĞİ.

... konulu sunumlar: "ENZİM KİNETİĞİ."— Sunum transkripti:

1 ENZİM KİNETİĞİ

2 Enzim kinetiği Biyokimyanın, enzimler tarafından katalize edilen reaksiyonların hızlarını ve bu hızları etkileyen faktörlerin sistematik çalışmasını inceleyen alanıdır. Kimyasal kinetiğin temel prensipleri geçerlidir. Kimyasal kinetik reaksiyon hızlarının kantitatif incelenmesi ile birlikte reaksiyonların mekanizmaları ile de ilgilenir. Enzim kinetiğinde ise daha çok reaksiyon hızlarının kantitatif incelenmesi ve buna etki eden faktörler incelenir.

3 Biomedikal Önem Enzimle kataliz edilen tepkimelerin hızını etkileyen faktörlerin tamamı (enzim derişimi, substrat derişimi, sıcaklık, pH ve inhibitörlerin varlığı) klinik için önem taşır. Ana biyolojik ilke olan hemostaz yönünden sağlığın iyi oluşu, beden iç ortamı bileşiminin nispeten dar sınırlar içinde tutulmasını gerektirir. Yani, sağlıklı olma, enzimle kataliz edilen yüzlerce tepkimenin sadece gerçekleşmesini değil, bunların, aynı zamanda uygun hızlarda ilerlemesini de gerektirir.

4 Biomedikal Önem Bu sağlanamazsa dokuların homeostatik dengesi bozulur ve tehlikeli sonuçlar ortaya çıkabilir. Dolayısı ile hekim, pH, enzim ve substrat derişimleri ile inhibitörlerin, enzimle kataliz edilen tepkimelerin hızını nasıl etkilediğini bilmek zorundadır. Enzimle katalizlenen tepkimelerden bazılarının hızı, metabolik asidoz veya alkalozu karakterize eden hücre içi pH’ daki kaymalara yanıt verir.

5 Biomedikal Önem Enzimle kataliz hızı, sıcaklıktaki değişikliklere artma ve azalma ile yanıt verdiğinden ateş ve hipotermi, enzimle kataliz edilen birçok tepkimenin hızını değiştirerek homeostazı bozar. Öte yandan, bu tehlikeli değişiklikler hekimin yararlanacağı hale getirilebilir. Örneğin, beden sıcaklığındaki düşmeye (hipotermi) tüm enzimlerin etkinliğinde bir azalmanın eşlik etmesi, açık kalp cerrahisi veya organ nakli cerrahisi sırasında genel metabolik istemde azalma sağlamak için kullanılabilir.

6 Cıva, kürar ve sinir gazları gibi metabolik zehirler toksik etkilerini, enzimleri inhibe edip dolayısı ile vazgeçilemez metabolik tepkimeleri yavaşlatarak veya ortadan kaldırarak gösterir. Günümüzde tedavide önem taşıyan birçok ilaç, bir kilit enzime ait doğal substrat ile yarışmaya girip metabolik tepkimelerin hızlarını düşürerek etki yapar. Bu ilaçlar çoğu kez doğal substratlara benzer. Bu konuya ait örnekler içinde, hiperkolesterolemi tedavisi için kullanılan lovastatin ve AIDS tedavisinde kullanılan zidovudin (AZT) bulunmaktadır. Her iki ilaç, tedavi edici etkinliklerini, enzimle kataliz edilen tepkimelerin hızlarını değiştirerek gösterir.

7 Kataliz Olayı Glukoz molekülünün laboratuvar şartlarında CO2 ve H2O ’ya dönüşümü termodinamik yönden mümkündür, fakat bunun için yüksek basınç ve sıcaklık gerekir. Hücre içinde ise aynı tepkime enzimlerin etkisiyle çok kolaylıkla gerçekleşmektedir. Bir enzim, bir maddenin bir ürüne dönüşümünü enzimsiz ortama göre kez hızlandırır, bir dakikada milyonlarca molekülün değişimini sağlar.

8 Her kimyasal reaksiyonda aktifleşme engelinin üst noktasına karşılık gelen bir ‘‘geçiş hali’’ veya ‘‘geçiş kompleksi’’ adı verilen ve etkileşen moleküllerin enerjice zengin hallerini gösteren durum vardır. E + R-L E-R + L E + R-L E..R..L ΔG1 E..R..L E-R + L ΔG2 ΔG= ΔG1+ ΔG2

9 Kimyasal kinetiğin kinetik veya çarpışma kuramı iki kavrama dayanır;
1-Moleküllerin reaksiyona girmesi için çarpışması veya bağ oluşturma mesafesi kadar birbirlerine yaklaşması gerekir. 2- Her kimyasal tepkime için bir enerji engeli vardır ve bu enerji engelinin açılması gerekir. Dolayısı ile moleküllerin kinetik enerjisini artıran, enerji engelini düşüren veya çarpışma sıklığını artıran faktörler tepkime hızını artırır.

10 Reaksiyona giren maddelerin ürünlere çevrilmesi için bir enerji engelini aşmaları gerekmektedir.
Bu enerji engeline AKTİFLEŞME ENERJİSİ denir. Bu enerji “Belli sıcaklıkta 1mol reaktanın aktifleşmiş durumu kazanması için gerekli enerji miktarı” şeklinde tanımlanır.

11

12 Enzimler aktivasyon enerjisini düşürürler fakat reaksiyonun tamamına ait ΔG’yi etkilemezler.
Böylece daha çok reaktanın geçiş kompleksi oluşturmasını dolayısı ile çok sayıda ürün oluşumunu sağlarlar.

13 Öğretmenim, enzim…!!!

14

15 Enzimlerin Katalizlediği Reaksiyonların Kinetiği
Enzimlerin katalizlediği reaksiyonların en önemli özelliği enzimlerin substrata ‘‘doyma’’ olayıdır. Düşük substrat konsantrasyonlarında reaksiyon hızı substrat konsantrasyonu ile orantılı olarak artar, yani reaksiyon substrata göre birinci derecedendir. Substrat konsantrasyonu artırıldığında reaksiyon hızının artışında azalma olur ve bu bölümde reaksiyon sıfırıncı ve birinci dereceler arasında karışık bir durumdadır.

16 Substrat daha da artırıldığında hız sabitleşir ve substrat konsantrasyonu ile değişmez.
Bu bölümde reaksiyon sıfırıncı derecedendir. Bütün enzimler doygunluk özelliği gösterirler. Yalnız her bir enzim için gerekli substrat konsantrasyonu farklıdır.

17 Reaksiyon hızını etkileyen faktörler
Substrat konsantrasyonu Isı pH

18 1913 yılında Leonor Michaelis ve Maud Menten, enzimli reaksiyonların ilk basamağında bir ES kompleksi oluşumundan ve doyguluk özelliğinden hareket ederek bir model geliştirdiler.

19

20 Km= (k2 +k3)/k1 Km=Michaelis sabiti denmiştir.
E + S k1k2 ES k3 E +P (1) Bu denklemdeki hız sabitleri tek bir terimde toplanmıştır ve Km denmiştir. Km= (k2 +k3)/k1 Km=Michaelis sabiti denmiştir.

21 Bu eşitliğe Michealis-Menten denklemi denir.
E + S k1k2 ES k3 E +P V=Vmax[S]/([S] + Km) Bu eşitliğe Michealis-Menten denklemi denir.

22 Michealis-Menten denklemi

23 Bu durumda Km; Maksimumu hızın yarısına karşılık gelen substrat konsantrasyonu olarak tanımlanır ve birimi mol/L dir. Michaelis-Menten denklemi enzimatik etkinin kantitatif incelenmesinde bütün enzimler için temel bir ifadedir.

24 Km ve Vmax değerlerinin önemi
Enzimlerin Km değerleri çok farklılık gösterir. Birçok enzim için bu değer M arasındadır. Km değeri enzim konsantrasyonuna bağlı değildir.

25 Substratın yapısı, pH, sıcaklık ve iyonik şiddet ile değişebilir.
Bir enzimin birden fazla substratı varsa her bir substrat için ayrı bir Km değeri vardır. Bu durumda Km, ES nin sağlamlık ölçüsüdür. Yüksek Km zayıf bağlanmayı düşük Km kuvvetli bağlanmayı ifade eder. Km enzimin substrat ilgisini gösterir.

26

27 Enzimlerin Vmax değerleri de birbirlerinden çok farklıdır.
Km de değişikliğe neden olan faktörler Vmax da etkiler. Vmax enzimin katalitik aktivitesinin bir ifadesidir.

28 Vmax ve Km Değerlerinin Grafikle Tayini
Bir enzimin kinetik özellikleri ile ilgili en faydalı bilgi Km ve V max değerlerinden elde edilir. Bu iki değer deneysel olarak bulunabilir. Değişik substrat konsantrasyonlarında hızlar tayin edilir. Bulunan değerler grafik çizilerek veya eşitlik formülü ile hesaplanabilir.

29

30 Michaelis Menten eşitliğini bir doğru denklemine dönüştürmek gerekir.
Buda eşitliğin her iki tarafı ters çevrilerek yapılır. Bu doğrunun çizildiği grafikte x=1/[S], y=1/V ve eğim m=Km/Vmax ve y ekseninin kesildiği nokta 1/Vmax olur. Bu eğriye Lineweaver-Burk Eğrisi adı verilir. Eğri x eksenini kesecek şekilde uzatıldığında kesme noktası –1/Km yi verir.

31

32 Enzim Hızına Etki Eden Faktörler
I- pH II-Isı III-Enzim Miktarı IV-Substrat Miktarı Bunların dışında süre, ürün, allosterik etki, inhibitörler, hormonlar gibi faktörlerde enzim aktivitesinde değişikliğe neden olur.

33 I-pH’ Etkisi pH enzim yapısında bulunan ve iyonlaşabilen grupları etkileyerek proteinin tersiyer veya kuaterner yapısını bozabilir. Enzimin aktif merkezinin iyonik yapısını etkileyerek aktiviteyi değiştirebilir. Substratın yapısında bulunan grupları etkileyip ES kompleksinin oluşmasını önleyebilir.

34 Optimum pH   pH’ın enzimatik tepkime hızına etkisi

35

36 II-Isının Etkisi Enzimlerin maksimum aktivite gösterdiği ısı değeri (optimum ısı) vardır. Bu ısı değerinin iki tarafındaki ısı değerlerinde aktivite düşer. Isı moleküllerin kinetik enerjisini artırarak hızı artırır. Sıcaklıkta 10oC’ lik bir artışın biyolojik bir olayın hızında yaptığı artış faktörüne Q10 veya sıcaklık katsayısı denir.

37

38 III-Enzim Miktarının Etkisi
Enzimatik bir tepkimede ortamda bol miktarda substrat varsa, reaksiyonun hızı enzim miktarı ile orantılı olarak artar. Substrat miktarı sınırlı olursa enzim miktarı artırılsa bile bir süre sonra Vmax erişilir ve substrat miktarı azaldıkça hızda da azalma gözlenir.

39 Enzim konsantrasyonun tepkime hızına etkisi

40 IV-Substrat Miktarının Etkisi
Substrat miktarındaki artış enzim aktivitesinde artışa neden olur. Enzim Vmax ulaştığında hızda artış gözlenmez. Substrat desteğinin sağlanması aktivitenin Vmax hızda devam etmesini sağlar.

41 Enzim Aktivitesinin İnhibisyonu
Enzim aktivitesinin inhibitör adı verilen bazı moleküllerle azaltılması veya tamamen durdurulmasına enzim inhibisyonu denir. I-Geri dönüşümlü (Reversible) inhibisyon II- Geri dönüşümsüz (Irreversible) inhibisyon

42 I-Geri dönüşümlü (Reversible) inhibisyon
İnhibitör sistemden uzaklaştırıldığında enzim aktivitesi tamamen düzelebilir. Üç farklı geri dönüşümlü inhibisyon tipi tanımlanmıştır. 1-Kompetetif (Yarışmalı) İnhibisyon 2- Nonkompetetif (Yarışmasız) İnhibisyon 3- Unkompetetif İnhibisyon

43 1-Kompetetif (Yarışmalı) İnhibisyon
İnhibitör (I) yapısal olarak substrata benzemektedir. I ve S enzimin aynı bölgesine bağlandığı için yarışma halindedirler. I kendine ait bir Ki değeri vardır. I enzimin substrata ilgisini azaltır ve Km artar. S miktarı artırılırsa Vmax ulaşılabilir.

44 Yarışmalı inhibisyon 4 farklı durumda ortaya çıkar.
1. tip; Substratla benzer yapıya sahip inhibitörler enzim aktif yüzeyi için yarışırlar. Örnek; süksinata yapısal olarak benzeyen malonat süksinat DHG inhibe eder. Sülfanamitler PABA analoğu olarak bakterilerde folat sentezini inhibe ederek antibakteriyel etki oluştururlar. Allopurinol (ksantin analoğu) XO (Ksantin oksidaz) inhibe eder.

45 Metotroksat, dihidrofolat redüktazı inhibe ederek DNA sentezini durdurur..
2. tip; İki substratlı yer değiştirme reaksiyonlarında ikinci substratın yüksek konsantrayonu bağlanma için 1. substratla yarışabilir. Örnek; L-Asp + -KGT  L-Glu + OAA  -KGT fazla olursa AST inhibe olur.

46 3.tip; Ürünün birikmesine bağlı olarak yarışmalı inhibisyon gözlenebilir.
Örn; inorganik fosfatları açığa çıkartan ALP’nin bu fosfatlar tarafından inhibisyonu. 4. tip; Bazı reaksiyonlarda kofaktör olarak metal iyonlarına ihtiyaç vardır . Benzer metal iyonları aktif bölgeye bağlanmak için kofaktörler ile yarışır. Ca+2, kofaktör olarak Mg+2 kullanan bir çok enzimi inhibe eder.

47 Yarışmalı inhibitörler bazı zehirlenmelerin tedavisinde kullanılırlar.
Metanol zehirlenmesinde etanol Etilen glikol (antifreeze) zehirlenmesinde 4-metilpirazol (fomepizole) verilir.

48

49

50

51

52 2-Nonkompetetif (Yarışmasız) İnhibisyon
İnhibitör (I) yapısal olarak substrata benzemez. I kendine ait bir Ki değeri vardır. I’li enzimin substrata ilgisi değişmez. Km sabit kalır. S miktarı artırılırsa da Vmax’a ulaşılmaz. Enzimlerin üç boyutlu yapısının sürdürülmesine katılan sülfidril gruplarını (-SH) içeren enzimler ağır metal iyonları tarafından inhibe edilirler.

53 Örneğin, ağır metal iyonları ( Ag+ gibi) enzimin aktif merkezinde veya konformasyonuda önemli olan sulfhidril (-SH) grubuna bağlanarak inhibisyon yapar. Kurşun zehirlenmesi anemiye neden olur. Şelatör ajanlar enzim aktivitesi için gerekli olan divalan metal iyonlarını enzimin yapısından uzaklaştırarak inhibisyona neden olurlar.

54

55

56 3-Unkompetetif İnhibisyon
I, ES kompeksine bağlanır. Hem Vmax hem Km düşer. Substrat miktarının artırılması inhibisyonu artırabilir. Bu inhibisyon daha çok çift substratlı reaksiyonlarda görülür. İntestinal ALP’ın L-Phe ile inhibisyonu gibi.

57

58

59 II- Geri dönüşümsüz (Irreversible) inhibisyon
Fizyolojik seperasyon yöntemleri ile I’ü E’den ayırmak mümkün değildir. SH gubu içeren enzimlerin iodoasetat gibi alkilleyici ajanlarla inhibisyonu geri dönüşümsüzdür. Organofosfat bileşikleri aktif yüzeyde seril OH grubu içeren enzimleri (Asetilkolin esteraz gibi) inaktive ederler. Diisopropilfosfoflorid (DPF) Asetilkolin esterazı inhibe eder. Kaslarda paralizi gelişir ve solunum yetmezliği ortaya çıkar. Siyanid sitokrom oksidazı inhibe eder.

60 Allosterik enzimler alt ünitelerden oluşurlar
Genellikle bir metabolik yolun ilk aşamalarında etkili enzimlerdir. Bu tip enzimlerin substrat ve tepkime hızı arasında çizilen grafiği sigmoidaldir

61

62 Enzimatik aktivitenin düzenlenmesi
Enzim aktivitesinin düzenlenmesinde etkili 5 mekanizma vardır: 1. Allosterik enzimler 2. Protein/protein etkileşimi 3. Kaskat sistemler /kovalent modifikasyon 4. Zimojen aktivasyon 5. Enzim sentezinin indüksiyonu veya represyonu

63 Heterotropik effektörler:
Bu tür effektörler substrat dışı maddelerdir ve çoğunlukla bu effektörler metabolik olaylar sırasında oluşan “ son ürünler” dir. Feed-back inhibisyonda bir son ürün, tepkimenin genellikle irreversibl olan ilk aşamasında görevli allosterik enzime bağlanarak onu inhibe edebilir.  

64 Homotropik effektörler:
Effektör eğer substratın kendisi ise etki homotropiktir. Enzim üzerine substratın bağlanması diğer substrat bağlama bölgelerinin substrat bağlamasını kolaylaştırır (kooperativite).