Endometriosiz, inflamasyon ve hormon reseptörleri

... konulu sunumlar: "Endometriosiz, inflamasyon ve hormon reseptörleri"— Sunum transkripti:

1 Endometriosiz, inflamasyon ve hormon reseptörleri
Orhan Bukulmez, M.D. Associate Professor and Division Director Division of Reproductive Endocrinology & Infertility Practice & Medical Director –IVF program Department of Obstetrics and Gynecology University of Texas Southwestern Medical Center Dallas, Texas

2 TIME Feb. 23, 2004

3 İnflamasyon birçok hastalığın patogenezinde önemli rol oynar
Cancer Pulmonary diseases Cardiovascular diseases Inflammation Neurological diseases Alzheimer’s disease Autoimmune diseases Diabetes II Arthritis

4 (NF)-kB/Rel :Transkripsiyon faktörleri
c-Rel NF-kB1 (p50 ve bunun ön bilesigi p105) NF-kB2 (p52 ve bunun ön bilesigi p100) p65 (RelA) RelB Klasik NF-kB kompleksi: Heterodimer: p65/RelA and p50 subüniteleri, hücrelerde inhibitor proteinlere bağlı olarak bulunur: “IkBs”. En bilineni IkBa olup NF-kB yi sitoplazmada tutup nükleer lokalizasyon dizilimini maskelemek ve de NF-kB proteinlerinin nükleusdan uzaklaştırılmasında rol oynar. Regüle ettiği fonksiyonlar Proliferasyon Differensiasyon Programlı hücre ölümü (Apoptoz) Tümörigenez T ve B hücre proliferasyonu ve gelişimi İnflamasyon “Master Regülatör” : İnflamasyon & İmmunite

5 NF-kB Activator Nucleus Cytoplasm p50 p65 IkBa p50 p65 p50 p65 IkBa
Ubiquitination & Phosphorylation IKK Nuclear import p50 p65 p50 p65 kB enhancer IkBa Degradation IkBa Nucleus Cytoplasm Garg and Aggarwal, Leukemia, 2002

6 NF-kB Aktivatörleri NF-kB ROS inducers Carcinogens Cytokines Infection
(H2O2, free iron, heme) Carcinogens (e.g: TNF, CSC, DMBA) Cytokines (TNF family, IL-1, IL-17, IL-18, EGF) Infection (bacterial/viral; e.g HIV, EBV-LMP, HTLV1, via TLRs) NF-kB Tumor Promoters (PMA) Stress (pH, hypoxia,stress heavy metals) Apoptosis-inducers Chemotherapeutic agents & g-irradiation Endotoxin (LPS) Aggarwal BB, Cancer Cell, 2004

7 Anormal NF-kB aktivasyonu gösteren majör hastalıklar
Kalp yetmezliği; iskemik reperfüzyon hasarı; Kardiak hipertrofi Multiple sclerosis Muscular dystrophy Alzheimer’s Inkontinentia pigmenti Ektodermal displazi Systemic inflammatory response syndrome: Septik şok Inflammatory bowel disease: Ülseratif kolit, Crohn’s Renal hastalıklar Neuropatolojiler H.Pylori gastriti Kanser, artrit, AIDS, astım, DM, Yaşlanma, Viral infeksiyonlar, Uyku apnesi, KOAH, Lupus, ENDOMETRİOSİZ* Kumar A, Takada Y, Boriek AM, Aggarwal BB. Journal of Molecular Medicine 2004;82:434-48 *Gonzalez-Ramos R et al Fertil Steril 2012;98:

8 NF-B’nin regule ettigi genler ve Endometriozis
Sitokinler (TNF*, IL-1, IL-6*, vs) Kemokinler (IL-8*, macrophage inflammatory protein (MIP)-1, monocyte chemotactic protein 1 (MCP1), regulated upon activation normal T cell expressed and secreted (RANTES), eotaxin) *Periton sıvısında endometrioizde artan düzeyler. Adhezyon molekülleri (E-selectin, vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) and intercellular cell adhesion molecule 1 (ICAM-1) Inducible enzymes (eg. COX-2, iNOS, caspases, MMP9) Cellular inhibitor of apoptosis protein (c-IAP1 &2), TNF-receptor-associated factors (TRAFs), B-cell lymphocyte-leukemia-2 (Bcl-2) homologs (A1/BFl-1, IEX-IL), Fas, c-myc and cyclin D1. NF-kB ayrıca TLRs, TNF and IL-1β, tarafından da aktive edilir: “pozitif oto-regulator siklus: Bir kere tetiklendiğinde inflamasyon gittikçe amplifiye olur ve iltihap cevabının şiddeti artar ve de süresi uzar. Chen. Nat Rev Mol Cell Biol 2004;5:392. Ghosh S et al. Annu Rev Immunol 1998;16:225. Karin M. Annu Rev Immunol 2000;18: Tam WF. Mol Cell Biol 2000;20:2269.Ghosh S. Cell 2002;109S:S81. Khan KN et al. Gynecol Obstet Invest 2009;68:40-52.

9 NR4A öksüz (orphan) nükleer reseptörler
Büyüme faktörleri ekspresyonunda rol oynayan erken cevap genlerindendir (sinir büyüme faktör aktivasyonu) İnflamasyona neden olan faktörlere çok hızlı cevap verir. NF-kB ekspresyonlarını artırır. Ekspresyon aktivasyonla korele Nur77 Nurr1 NOR1 Nurr1: Timus, osteoblastlar, karaciğer, pituiter bez Nor1:Pituiter bez, timus, böbrek, kalp, iskelet kası, adrenal Nur77 çoğu hücre sisteminde bulunur: Ekpresyonu NF-kB aktivasyonu ile koreledir Nur77 diğerlerine kıyasla endometriyum ve endometriosizde saptanabilen yegane NR4A grubu reseptördür NFkB aktivasyonunun doğrudan olmayan bir göstergesidir Pei et al J Biol Chem 2005;29256 Suzuki et al PNAS 2003;100(14):8276 Harant & Lindley Nuc Acid Res 2004;32:5280

10 Estrogen receptor (ER)
ER 1986 (ERa) ERb 1996 17b-E2 her ikisine de eşit duzeyde bağlanır (ERa ERb) ERb yaygın olarak bulunsa da uterus çok yüksek bir ekspresyon göstermez. Prostat, tükrük bezleri, testis, over, vasküler endotel, düz kas, bazı nöronlar, bağışıklık sistem hücreleri Harris Mol Endocrinol 2006

11 ERb ERa agonist proliferation E2 Cell line no effect
(HC11) ERb agonist proliferation (lact.mammary gl) Faulds et al. Mol Endocrinol 2004;18:412:421 Expressed in developing uterus, switching to ERa when completed Keeps uterus quiescent before ovary secretes E2 (3bAdiol) Cervical ripening, decidualization in adult uterus Lost in endometrial cancer Plays important role in elastic recoil of uterus –blockade&prolapse Highly expressed in granulosa cells No consensus bERKO mice phenotype Koehler et al Endocr Rev 2005:26:465 Paul et al Cancer Invest 2004;22:211

12 Structural domains of the human ERa and ERb
Koehler, K. F. et al. Endocr Rev 2005;26:

13 ERb nın hayvan modelleri üzerine etkileri
Non-selektif estrogenler NF-kB aktivasyonuna bazı sistemlerde engel olabilir Estrojenin bu tür anti-inflamatuvar ERb üzerinden olabilir ERb selektif agonistler fare inflamatuvar artrit modelinde yaralı bulunmuştur Yine IBH (UC gibi) modelinde etkilidir Travma-kanama modelinde akciğer hasarını IL-6, iNOS, LDH yı düşürerek azaltır MI & sepsis modellerınde yararlı (survivalı artırıyor) ERb -/- mice: myeloproliferative disease ERa -/- mice: autoimmune disease (GN)

14 ERb Regulasyonu? >10 izoform
E2 verilen sağlıklı sıçanlarda ERb ya bağımlı genler gösterilememiştir Sadece hayvan strese maruz kaldığında ya da hastalandığında fonksiyonları önem kazanabilir. “Challenge hypothesis”

15 ERb & Endometriozis Sıçan Eosiz modelinde sadece ERa görülmüş
ERb babun endometriotik lezyonlarında gösterilmiş ERb agonist sıçanda Eosis implantlarını yok etmiş i ERb agonist stimulating macrophages/NK cells ? İnsan endometriumu: ERb mRNA epithel hücrelerinde, daha çok proliferatif fazda Endometrioma: ERa mRNA dominant ancak ERb daha artmış bir durumda ER ve PR supresyonunda etkin olabilir Harris et al Human Reprod 2005;20:936; Matsuzaki et al Fertil Steril 2000;73:1219 Faleabas et al. Fertil Steril 2003;80:820; Bulun et al Semin Reprod Med 2012;30:39

16 Progesteron Reseptörü
PR mRNA ekspresyonunu E2 regüle eder ancak PR promoterinde ERE yoktur Promoterde birçok transkripsiyon faktörü mevcuttur PR ekspresyonu ERa tarafından pozitif yönde regüle edilir Kastner et al EMBO J 1990;9:1603 Hewitt & Korach Steroids 2000;65:551 Bulun et al Semin Reprod Med 2012;30:39

17 NH2 COOH NH2 COOH NH2 COOH PR-B mRNA 1 2 3 4 5 6 7 8 PR-A mRNA 1 2 3 4
AUG1 AUG2 AUG5 PR-B mRNA 5’ 1 2 3 4 5 6 7 8 3’ AUG2 AUG5 PR-A mRNA 5’ 1 2 3 4 5 6 7 8 3’ AUG5 PR-C mRNA 5’ 2 ??? 3 4 5 6 7 8 3’ PR-B NH2 BUS 1 DBD 2 3 4 LBD Both hPR-A and hPR-B bind to progesterone response elements (PRE), however hPR-A lacks one of three transcriptional activation domains that are present in hPR-B (Kastner et al.,1990). hPR-B has been demonstrated to activate a wide variety of target gene promoters on which hPR-A is inactive, yet increasing concentrations of hPR-A represses hPR-B-mediated transcription in a cell- and promoter-specific manner (Vegeto et al., 5 6 7 8 COOH PR-A NH2 DBD LBD COOH PR-C NH2 LBD COOH

18 PROGESTERONE RECEPTOR ISOFORMS
BUS DBD LBD PR-B PR-A PR-C PR isoforms (many more): PR-A, PR-B and PR-C. PR-B (116-kDa) is a strong transactivator of PR target genes. PR-A (94-kDa) may inhibit PR-B transcriptional activity in a cell type and promoter-specific context?? PR-C (64-kDa) may be a suppressor of progesterone action and forms heterodimers with PR-B which interferes with PR-B-DNA binding.-one of the truncated isoforms of PR So first lets look at the progesterone receptor It comes in 3 isoforms PRA, B, and C PR B the longest form is also considered the active form, regulating the expression of genes that maintain uterine queiscence through out pregnancy PRA is shorter and has been found to inhibit the actions of PRB in a tissue and promoter specfic manner And PR-C the long ignored isoform has been shown to also inhibit PR B action by forming heterodimers with PRB and as it is predominantly found in the cytoplasm has been shown to sequester progesterone in the cytoplasm thereby reducing the transactivation function of PRB

19 PR A&B izoformları PRA daha çok endometrial stromada (94-kDa)
Endometriosis implantlarda daha fazla ER aktivitesini inhibe edebilir P4 direncinde rol oynayabilir Meme kanserinin adhesivitesini artırabilir Fonksiyonu daha çok P4 yoksunluğu olan durumlarda ortaya çıkabilir PRB daha çok endometrial glandlarda (116-kDa) E2 tarafından endometrium ve T47D hücrelerinded özellikle artılırılan izoform Attia et al JCEM 2000;85:2897 Jacobsen et al Mol Endocrinol 2005;19:574

20 PR C (non A, non-B, kesilmiş transkriptler)
> 7 transkript (aynı PR geninden) Hem nükleer hem sitoplazmik Tam bir DNA binding domaini yoktur Nükleus lokalizasyon sinyali mevcuttur Sitoplazmik fonksiyonu ?, diğer TF lerle ilişkisi ? P4 u bağlar ama genomik etkisine engel olabilir: ”Functional P4 withdrawal” PR B ye bağlanarak (heterodimer) PRE ni etkileme kapasitesini azaltabilir Taylor et al Endocrinology 2006;147;687 Condon et al Mol Endocrinol 2006;20:764 Wei et al J Steroid Biochem Mol Biol 1997;62:287

21 Progesterone Causes a Rapid Induction of IkBa Expression and Blocks
IL-1-Mediated Degradation of IkB Protein (hTERT myometrial cell line) Q-PCR Time (h) 20 40 60 80 100 120 0.25 2 6 12 I k B a Expression (Arbitrary Units) Control Progesterone (P4) Anti-inflammatory actions of the GR have also been found to be associated with induction of the NF-kB inhibitor, IkB in certain cell types. We, therefore, examined the effects of progesterone on IkB mRNA and protein levels using Q-PCR. As can be seen, progesterone caused a rapid and marked induction of IkB mRNA. This was associated with an inductive effect on levels of IkB protein. As expected IL-1 decreased IkB protein levels, presumably by proteolysis via the proteasome pathway. Interestingly, in cells co-incubated with IL-1 and progesterone, P blocked IL-1 mediated degradation of IkB. IkBa (37 kDa) C IL-1b P4 IL-b + P4 6 h Immunoblot

22 Progesterone Reduces NF-kB p65 Binding to the Distal COX-2
Promoter in hTERT Myometrial Cells -447 aggggattccc Distal TATAAA 1 4 5 3 2 8 7 6 3’ 5’ 9 10

23 Progesterone Suppresses the IL-1b/cAMP-induced Expression of Aromatase Promoter IIa mRNA in T47D Breast Cancer Cells. Aromatase mRNA Knowing that progesterone impairs COX-2 expression, we next examined whether progesterone suppresses the expression of aromatase in breast cancer cells. After treatment of T47D cells with IL-1 and/or cAMP, there was an marked increase in the expression of the ovarian aromatase (promoter IIa) mRNA transcripts after 24 hours. Moreover, co-treatment with progesterone with either IL-1 or cAMP suppressed this induction of aromatase. A simliar effect was observed with aromatase promoter 1.3. Control IL-1b cAMP

24 Progesterone is Unable to Induce IkBa in PR-A/B Deficient T47D Cells
Treatment Lipid PRB PRA Mismatch PR-B PR-A actin n=3 [Progesterone] = 100 nM

25 Ablation of PR-A and PR-B Induces Expression of hCYP19
Promoters IIa and I.3 in T47D Cells siRNA: PR-B PR-A/B MisM PR-B PR-A Actin To further analyze the effects of PR and its isoforms on basal levels of hCYP19 expression from promoters I.3 and IIa, Dan transfected T47D cells with siRNAs specific for PR-B alone and PR-A and B and analyzed exon I.3 and IIa-specific transcripts using Q-PCR. An immunoblot of PR-A and B protein levels is shown in the upper panels. As you can see, reducing the levels of PR-B protein had no effect on expression of these CYP19 mRNA transcripts. By contrast, ablation of PR-A + PR-B caused a marked induction of CYP19 gene expression. It should be noted that the cells were cultured in serum-free medium in the absence of progesterone. We postulated that PR inhibits CYP19 expression through its action as an anti-inflammatory factor, specifically through an effect to inhibit expression of COX-2, the rate-limiting enzyme in prostanoid synthesis.

26 Structure of the Human CYP19 Gene:
5’-Untranslated Regions of CYP19 mRNA Transcripts are Encoded by Unique Tissue-Specific First Exons (5’UTRs) Exon If Brain Exon I.1 Placenta Exon I.4 Adipose ATG Exon IIa Gonads HBR AATAAA ATTAAA II III IV V VI VII VIII IX X 34.1 kb 92.6 kb I.3 Breast Cancer The human CYP19 gene spans ~130 kb of DNA. Aromatase mRNA transcripts in all tissues contain the same protein-coding exons (II-X); however, they have unique 5’-UTRs, which are encoded by alternative first exons that lie at various distances upstream, and are alternatively spliced onto a common site within exon II just upstream of the translation initiation site. Sequencing of the human genome has revealed that the placenta-specific first exon (I.1) lies ~95,000 bp upstream, the adipose-specific first exon, I.4, lies ~60,000 bp upstream, the brain-specific first exon lies 40,000 bp upstream. By contrast the exons encoding the 5’UTRs utilized in gonads and in breast cancer lie quite close to exon II. The coding region and encoded protein (58kDa), however, are identical regardless of the promoter used Bulun et al Pharmacol Rev 2005

27 Endometriotik stromal hücrelerde aromataz ekspresyon regülatörleri
Negatif/nötral regülatörler Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 2 (COUP-TF2) PGE2 receptor EP1 and EP3?: No change or suppression in some systems Pozitif regülatörler SF-1 cAMP CREB (cAMP response element binding protein) PGE2* PGE2 receptor EP2, EP4 subtypes COX-2* Cytokines*: IL-6 &11, TNFa, Cortisol (promoter I.4) * NF-kB regulated factors Noble et al 1996/1997, Zeitoun et al 1999, Richards&Brueggemeier 2003

28 Aromataz İndüksiyonu: Lokalize bir olay
Periton sıvısında steroid hormon düzeylerinde endometriosiz hastlarında kontrol hastalara kıyasla bir fark gözlenmemiştir (sitokin verilerinin tersine) Mahmood & TempletonBr J Obstet Gynaecol Feb;98(2):

29 Periton Endometriozisi Vesiküler, saydam, kırmızı lezyonlar
Erken implantlar proliferatif endometriumu andırır Düşük sitokeratin and vimentin ekspresyonu “immaturity” (celllular disorganization) Yüksek P.Sıvı sitokin düzeyleri (IL-8) Yüksek glandüler mitotik indeks (Ki-67) Yüksel MMPs –tüm menstrual fazlarda Sonunda kahverengi/siyah ve skarifikasyon

30 Peritoneal Endometriosis Black Lesions
Presence of intraluminal debris Scarification, decreased vascularization No typical Progesterone changes Eventual white fibrotic lesions

31 Bukulmez et al Endocrinol 2008;149:1190
AROMATAZ: B- Negatif Ktrl red C-Kırmızı D-EU(geç prolif.) E-sıyah F-EU(sekr.) G-Eoma H-Normal uterin periton (seroza) I-Plasenta “Lokal yama tarzı aromataz lokalizasyonu, kırmızı implantlarda en yüksek derecede” Bukulmez et al Endocrinol 2008;149:1190

32 CYP19IIa Endometrium (A,B) ve İmplant/EU oranı (C)
EU aromataz mRNA<< Eosiz implantlar (Fig C) Luteal P4 EU aromataz ekspresyonunu suprese ediyor (B) rASRM evresi EU aromataz ekspresyonunu değiştirmiyor ancak implant aromataz ekspresyonu evre I-II de artıyor C

33 CYP19IIa Lezyonlar; morfoloji, menstrual faz, periton
En yüksek aromataz kırmızı implantlarda (A) Menstrual faza göre implantlarda değişiklik yok (B) Yani luteal P4 implantlarda aromataz ekspresyonunu etkilemiyor D-MPA tx suprese etse de, ekspresyon düzeyleri EU’ya göre yüksek İmplantlarda Sınırlı Progestin etkisi İleri evrede peritonda artmış ekspresyon (C)

34 Aktivatör Supresör 855 377

35 COX-2 mRNA & ERβ mRNA to ER mRNA oranı
COX-2 en yüksek kırmızı implantlarda-Akut inflamasyon ERβ/ER oranı en yüksek endometriomalarda-Kronik inflamasyon

36 ERβ Immunostaining A/B Prostat -/+; C-Ctrl sekret endo. D-EU geç sekr, E-Eoma F-Eoma G-Kırmızı H-Siyah I-Periton (evre II) endotelde Bukulmez et al Endocrinol 2008;149:1190

37 PR

38 No PR-A in endometrioma cyst wall (chronic inflammation)
Ctrl endometrium (Late prolif) EU (Secretory) Red Implant (Acute Inflammation) Endometrioma

39 Nur 77 mRNA: En yüksek endometriomada
Kronik inflamasyon göstergesi mi? n= n= n= n= n= n=4 Bukulmez O. Minerva Ginecol 2009;61:599

40 Negatif regülatör PG reseptörü

41 Can inflammation affect oocyte quality?
PLoS one 2012;7:e35535 IL-6 induced deterioration in microtubule and chromosomal alignment in mouse oocytes

42 Inflammation and PTEN-PI3K-Akt-Foxo3 system
Endometriosis & P53 alterations PTEN (10q) and K-ras mutations PTEN mutations 12.5% of endometriotic tissues Increased mismatch repair abnormalities is associated with increased CRP levels Remember 10q26 linkage peak in endometriosis Chronic inflammation associated with mismatch repair abnormalities

43 Trends Endocrinol Metab 2010;21:96-103.
Genetically modified mouse models with oocyte-specific deletion of genes in the PTEN (Chr 10)-PI3K-Akt-Foxo3 pathway exhibit premature activation of all dormant follicles. PTEN inhibition and PI3K activation lead to Akt ‘P’lation and Foxo3 nuclear export in oocytes in primordial follicles resulting in follicular activation shown by increased AMH level Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107: Trends Endocrinol Metab 2010;21:

44 Aromatase PF ERb PR-B PR-A ERa E2 NF-kB PR-C Aromatase/Survival Nur77
Eutopic Endometrium Aromatase Retrograde menstruation PF A4,T E2 Aromatase/Survival PF ROS Attachment Mesothelial injury Implantation NF-kB Nur77 PR-C Cytokines- COX-2- Chemokines-Adhesion molecules-Apoptosis inhibitors ERb PR-B PR-A ERa Aromatase Red lesions Black lesions Fibrosis Deep endometriosis Apoptosis E2

45 Sonuç Endometrioma kist kapsülü-Kronik inflamasyon: İmplantlara göre daha düşük aromataz ve COX-2, düşük/yok PRA, yüksek SF-1 ve CEBP; yüksek ERβ/ER oranı, yüksek PR-C, yüksek Nur77 İmplantlar; kırmızı: Yüksek aromataz, yüksek SF-1, yüksek COX-2, daha düşük PR-C; implantlarda genel olarak yüksek EP2, EPI3, EPI4 (cAMP coupled) İnflamatuvar cevabın statüsüne göre dokulardaki aromataz ve nükleer reseptör ekspresyonu değişmektedir. Sellüler kompozisyon lezyon morfolojisine göre variyasyon gösterir: Akut (kırmızı): epitel hücreleri, inflamatuvar sızıntı. Kronik (Eoma): stromal hücreler, histiositler, fibroblastlar. PR-C gibi kesilmiş PR izoformları ve ERβ ekspresyonu kronik inflamatuvar cevapla korele olabilir Endometriozisin hormonal tedavisinin beklenen başarıyı gösterememesinden lezyonlardaki inflamasyona bağlı değişiklikler sorumlu olabilir.

46 Araştırma konusu Pelvik endomteriosizin medikal ve/veya cerrahi tedavisi pelvik ve de ovarian inflmasyonu kısıtlıyarak ya da elimine ederek endometriosizle ilişkilendirilen azalmış over rezervini engelleyebilir mi? Teşekkürler!

47 Endometriosis/Receptors-reports
Most implants (90%) are out of phase with menstrual cycle ER and PR reduced as compared to eutopic endometrium (black lesions, deep lesions) Increased ER in implants (Red lesions) No cyclic changes in deep lesions Reduced exon 5 deleted splicing variant mRNA of ER-alpha (vs eu.endometrium) ER-a/ER-b mRNA 15.5 in eutopic endometrium, 5.5 in endometriomas (deep) Higher ER-b/ER-a in endometriomas (vs eutopic) Higher PR-B mRNA in endometriomas No PR-B in extra-ovarian endometriotic tissues

48 Endometriosis/Enzymes
Aromatase localized in cytoplasm of epithelial glandular cells of endometriosis implants Less 17bHSD2 in implants Eutopical endometrium:aromatase can be expressed in the presence of severe endometriosis, adenomyosis, leiomyomas